SN_T 1087-2011Q热检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1087—2011代替 SN/T 1087--2002Q热检疫技术规范Quarantine protocol for Q fever2011-12-01实施2011-05-31发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1087—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1087-—2002《牛Q热微量补体结合试验操作规程》。本标准与SN/T1087—2002相比，主要技术变化如下：增加了病原分离和鉴定；增加了间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验方法。本标准同等采用世界动物卫生组织（OIE）《Manual of Diagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals》(2008 版)中第 2.1.12章 Q热部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：志强、柯忠哲、马保华、鱼海琼、林志雄、李贺、林宝珍、陈升毅、吕平、刘计亮、朱来华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1087—2002。 SN/T 1087--2011Q热检疫技术规范1范围本标准规定了Q热的检疫规范，包括病原分离鉴定、血清学试验，其中血清学试验包括酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验和补体结合试验。本标准适用于进出境牛、羊等易感动物Q热的检疫和诊断。缩略语2下列缩略语适用于本文件。Q Fever:Q热C.Burnetii:伯纳特柯克斯体ELISA：酶联免疫吸附试验IFA：间接免疫荧光试验HEI:人胚肺成纤维细胞CPE:细胞致病效应PBS:磷酸盐缓冲液FITC:异硫氰酸荧光素RNA:核糖核酸OPD:邻苯二胺OD值：光密度值VBD:巴比妥钙镁缓冲液LPS:脂多糖3 临床症状Q热临床症状及其他信息参见附录 A。4检疫方法4.1病原分离和鉴定4.1.1材料准备器材：荧光显微镜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、25cm²细胞培养瓶、24孔平底细胞培养板、带盖湿盒、组织捣碎机、冷冻离心机。4. 1. 1.2 试剂:4. 1. 1.2. 1 无 C. Burneti抗体特牛血清。.2人胚肺成纤维细胞（HEI）。1 SN/T 1087-20.3C.Burnetii标准菌株和标准阳性、阴性血清、C.Burneti荧光抗体。.4溶液及细胞培养液：见附录 B。1日龄～2 日龄豚鼠。链霉素、庆大霉素。样品：胎盘子叶、肺、肝、流产胎儿皱胃内容物；母畜阴道分泌物、奶样、粪便。4.1.2样品的处理将样品剪碎，在组织捣碎机内捣碎，用含抗生素（链霉素100 μg/ml.～2001g/ml.和庆大霍素50 μg/mL～100μg/mL)的PBS磷酸盐缓冲液制成组织悬液，于4℃作用4h.3000r/min离心后.保留上清液。4.1.3病原分离对无污染的样品，按常规方法培养HEL单层细胞，倒去培养液，接种样品组织上清液.每样接种3瓶。每瓶接种1mL。于37℃吸附2h后加细胞维持液，封闭、置37℃二氧化碳箱培养，24h后逐日在倒置显微镜下观察细胞病变，连续观察 21d C.Burnetii特征性CPE(细胞致病效应）：HEI细胞空泡化。无CPE的盲传2代。如有CPE，则待70%细胞出现CPE时收毒，将细胞反复冻融2次，3000r/min离心20min。取上清液4℃保存待鉴定。4.1.4培养物的鉴定将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成2×10°/mL的细胞悬液.加人到24孔细胞培养板内，每孔3mL，封闭、置37℃二氧化碳培养箱培养。等细胞生长成80%的单层，吸出孔内培养液，接种4.1.3待鉴定上清液.每孔3ml..每个样品2个孔；另外4.1.3上清液用适量C.Burneti阳性血清中和后接种2个孔，每孔3ml：阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物，每个对照2个孔。置37℃二氧化碳培养箱吸附2h吸出各孔内所加的待检和对照样品，加人维持液，每孔3mL，封闭、置37℃二氧化碳培养箱培养 10 d。取出细胞板，PBS漂洗，自然干燥后，用一20℃预冷的丙酮固定30min，用PBS洗3次.每次5 min，自然干燥。滴加适量 C.Burneti阳性血清，置 37℃作用1 h。滴加适量C.Burneti免疫荧光抗体（二抗），放进湿盒，37℃作用2h。用 PBS洗 3次,倾去液体。荧光显微镜镜检。4.1.5结果判定阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内。阴性对照、空白对照无荧光。没有经过阳性抗体作用的细胞荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光·则判为阳性。没有