SN_T 3306.11-2017国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第11部分：副溶血性弧菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3306.11—2017国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第11部分：副溶血性弧菌Loop-mediated isothermal amplification detection methodat frontier port-Part 11 :Vibrio parahaemolyticus2017-12-01实施2017-05-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局0oaa、刮涂层查真伪 SN/T 3306.11-—2017前言SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；第2部分：产毒素霍乱孤菌；第3部分：志贺氏菌；一第 4部分：嗜肺军团菌;-第5部分：布鲁氏菌；第6部分：黄热病毒；第 7部分:猴痘病毒；第8部分：基孔肯雅病毒；第9部分：结核分枝杆菌；第10部分：炭疽芽孢杆菌；-第11部分:副溶血性弧菌；第12部分：空肠弯曲菌；第13部分：疮原虫；第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第11部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本部分主要起草人：李智慧、王飞、闫冀焕、潘娟、柴宏森、祁军。 SN/T 3306.11--2017国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第11部分：副溶血性弧菌1 范围SN/T3306的本部分规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增（LAMP)法检测副溶血性弧菌的检测对象、检测程序及检测结果的报告。本部分适用于国境口岸副溶血性弧菌菌株的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验　副溶血性弧菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489　实验室‧生物安全通用要求WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用WS 271感染性腹泻诊断标准人间传染的病原微生物名录（卫科教发【2006715号）3缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine:甜菜碱。Bst 酶:Bst DNA 聚合酶(大片段)[Bst DNA polymerase(large fragment)］DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)dNTP:脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid)LAMP:环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification)Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全及防污染措施实验生物安全要求、操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。5技术概要根据副溶血性弧菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对,共三对引物，特1 SN/T 3306.11—2017异性识别靶序列上的M36437基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg?+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可加人显色液，通过观察颜色变化判定结果。6　试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。6.1 引物。根据副溶血性孤菌特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1,环状引物2。外引物 1(F3,5-3):AGCTACTCGAAAGATGATCC外引物 2(B3,5-3):GGTTGTATGAGAAGCGATTG内引物1(FIP,5-3）:ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT内引物 2(BIP,5′-3′):ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG环状引物1(LF,5-3):ACCAGTAGCCGTCAATG环状引物 2(LB,5-3