SN 1109-2002新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1109 -- 2002新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程Procedure of haemagglutination-inhibition testfor Newcastle disease2002-05-20 发布2002-11-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1109--2002前言本标准等效采用国际兽医局的标准《诊断方法和疫苗标准手册》（2000年，第四版），并参考中华人民共和国进出境动物检疫规程手册编写、制定。本标准的附录A、附录 B为标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标主要起草人：胡永强、单松华。本标推系首次发布的出人境检验检疫行业标推。1 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准新城疫微熨红细胞凝集抑制SN/T 1109-2002试验操作规程Procedure of haemagglutination-inhibition testfor Newcastle disease1 范围本标推规定了禽类新城疫微量红细胞凝集抑制试验方法。本标准适用于禽类新城疫红细胞凝集抑制抗体水平的检测。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准必威体育精装版版本的可能性。国际兽疫局《诊断方法和疫苗标手册》（2000年，第四版）3仪器设备、试剂和材料所有试剂均为分析纯。3.1器材普通天平、分析天平、普通离心机、V型血凝板、微型振荡器、50μL可调移液器、恒湿箱、塑料采血等。3.2试剂磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、葡萄糖、柠檬酸钠、蒸馏水。3.3稀释液pH7.0 或至 pH7. 40. 01 mol /L 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(见附录 A标准的附录)。3.4新城疫标准抗原由指定单位供应，或用标准新城疫(ND)毒株尿囊腔接种 9～11 日龄无特定病原体(SPF)鸡胚，收集尿囊液灭活制备抗原。3.51%鸡红细胞采集 SPF鸡或无新城疫血凝抑制抗体的成年鸡血，放人等量的阿氏液(见附录B标准的附录)中，用 20倍体积的 PBS洗涤 3～4次，每次以2 000 r/min离心3～4min，最后一次5min，用 PBS配成1%悬液。4℃保存悬液,在 72 h 内使用完。3.6 血清3.6.1标准阳性/阴性血清：由指定单位供应。3.6.2被检血清：采、送的样品。样品以1000r/min离心5min，吸出血清待用。若需较长时间保存血清，可置于4℃或一20℃。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-05~20批准2002-11~01 实施1 SN/T 1109 --- 20024操作方法4.1 微量血凝试验(见表 1)单位;μL微量血凝试验操作术式表 1 1112 4536789103孔照745623滴度(log2)25 125 2525)25 )25 125 [25 /25 ]25 125 125 1PBS25 / 2525 25 J25 J25 J25 2525 [2525 J25 J抗原(倍比稀释)2525 25 252525252525252525PBS2525252525252025252525251%鸡红细胞18℃C~20 C,静墅 40min 左右作用时问及温度+++++++++++++++++++++++++++++++++于+判定举例4.1.1在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μLPBS，共加四排。4.1.2吸取一定倍数稀释的抗原25μL加于第1列孔，充分混合后移出25μL至第2列孔，依次类推做等量倍比稀释至第11列孔，第11列孔弃去25μL。4.1.3设立第12列孔为红细胞对照。每孔再加25μLPBS。4.1.4每孔各加人1%鸡红细胞悬液25μL。4.1.5立即置微型振荡器上混合 1 min，或手持血凝板绕圆圈混匀。4.1.6置 37℃静置15 min～20 min，或室温(18℃～25℃)静置 40 min左右，或 4C静置 60 min(如果4.1.7环境温度太高时）。4.1.8结果判定：期间观察数次，直至对照的红细胞全部沉淀(此时为一个圆点）。将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪珠样流挂，根据血凝图像判定结果。HA效价高于21时可继续增加稀释的孔数。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度（红细胞无泪珠样流挂），该血凝滴度代表了一个血凝单位，再根据初始稀释度计算抗原的血凝单位。4.1.94个血凝单位的标定：根据4.1.8测定的抗原的血凝效价，计算4个血凝单位抗原的稀释倍数。方法举例为：如抗原HA效价为2°，其4个单位