SN_T 3964-2014番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3964—2014番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Tomato severe leaf curl virus2014-11-01实施2014-04-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3964—2014前言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张永江、邓丛良、沈建国、廖富荣、粟智平、鲁洁、朱水芳、李明福、李桂芬、魏梅生。I SN/T 3964—2014番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了番茄严重曲叶病毒的免疫学及分子生物学等检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带番茄严重曲叶病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定，2番茄严重曲叶病毒基本信息学名:Tomato severe leaf curl virus缩写:ToSLCV分类地位：双生病毒科（Geminiviridae），菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。传播途径：主要通过烟粉虱（Bemisia tabaci）传播，也可通过嫁接传播。番茄严重曲叶病毒的其他信息参见附录A。3原理根据番茄严重曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA)检测；根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定4仪器设备、用具及试剂4.1仪器设备酶标仪、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、多功能电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、4℃冰箱、电子分析天平（0.001g）、恒温水浴锅、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅及制冰机等。4.2主要用具可调移液器（2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL）、离心管、PCR管、酶标板及研钵等。4.3主要试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)试剂见附录B，常规PCR检测试剂见附录C。5检疫鉴定方法5.1检测样品的制备5.1.1苗木：有症状(如植株矮化、叶片畸形、卷曲、皱缩等)的苗木单独编号，每株采集症状叶片5g用于后续检测；无症状的植株每10株分为1组并编号，混合采集植株顶部叶片5g用于后续检测。1 SN/T 3964-—20145.1.2植物产品：有症状的植物产品单独编号,取症状部位0.5 g用于后续检测；无症状或无法观察症状的植物产品，分组编号后混合采样0.5g用于后续检测。5.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)具体操作步骤见附录 B。5.3常规 PCR 检测提取样品DNA，设置阳性对照、阴性对照和空白对照，进行常规特异引物 PCR检测或常规通用引物 PCR检测。具体操作步骤见附录 C。5.4实时荧光PCR 检测提取样品DNA,设置阳性对照、阴性对照和空白对照，进行实时荧光 PCR检测。具体操作步骤见附录 D。6结果判断同时符合双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)和常规特异引物PCR检测结果为阳性的，判定待检测样品携带番茄严重曲叶病毒。采用常规通用引物PCR进行检测，当检测结果为阳性时，则进行序列测定，测定序列经比对分析为番茄严重曲叶病毒的,判定待检测样品携带番茄严重曲叶病毒。实时荧光PCR检测结果为阳性的,判定待检测样品携带番茄严重曲叶病毒。7样品保存与记录结果7.1样品保存检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一80℃冰箱中，并作好登记和标记，以备复核用7.2结果记录包括样品来源、种类、取样人员、检测原始记录、照片等文档按有关规定作好登记、标记和存档，以便必要时复核。2 SN/T 3964—2014附录A（资料性附录）番茄严重曲叶病毒背景资料A.1寄主范围寄主植物包括番茄属（Lycopersicon spp.）、辣椒属（Capsicum spp.）、茄属（Solanum spp.）、藜属(Chenopodium spp.）、蓼属（Polygonum spp.）、滨藜属（Atriplex spp.）、Halogetum 属、烟草属（Nic-otiana spp.）、独行菜属（Lepidium spp.）、拟漆姑属（Spergularia spp.）、苋属（Amaranthus spp.）及锦葵属(Malva spp.)。A.2病害症状侵染寄主植物导致植株矮化及叶片卷曲或皱缩（图