SN 1612-2005香石竹环斑病毒血清学检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1612—2005香石竹环斑病毒血清学检测方法Serological detection method of carnation ringspot dianthovirus2005-08-18 发布2006-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1612-2005前 言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陶庭典、易建平、印丽萍、杨翠云、戚龙君、朱伟组。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 1612--2005香石竹环斑病毒血清学检测方法1范围本标准规定了香石竹环斑病毒的 DAS-ELISA 检测方法。本标准适用于香石竹种苗以及其他进境植物种苗中香石竹环斑病毒的检测。2 缩略语下列缩略语适用于本标准。DAS-ELISA:双抗体夹心 ELISA Double antibody sandwich ELISA。PBS:磷酸盐缓冲液 Phosphate Buffer Saline。10×PBS:10倍浓度的PBS母液。PBST:含 Tween-20 的 PBS.SEB:样品抽提缓冲液Sample Extraction Buffer。CB;包被缓冲液 Coating Buffer。3 病毒概述3.1 病毒学名Carnation ringspot virus,缩写:CRSV.3. 2病毒粒体等轴对称二十面体，直径约 34 nm。3.3病毒分类属于番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）、香石竹环斑病毒属（Dianthouirus），是 Dianthovirus 属的典型成员。3. 4病毒稳定性体外存活期：20℃下50d～60d;稀释限点10-5；致死温度：80℃（10min)。3. 5自然寄主主要自然侵染香石竹，德国从苹果、梨等果树上分离到该病毒。3.6分布主要发生在中亚、欧亚以及北美地区。印度、澳大利亚也有发生。3.7 传播主要通过种苗进行远距离传播。3. 8血清学特性病毒具有极强的免疫原性，微量沉淀法测得的抗体效价超过1/4000。多种血清学方法均对该病毒有好的检测效果。4仪器或器具4.1 酶联板。4.2可调式移液器(2.5 μL、10 uL、100 μL、200 μL、1 000 μL各一支)及相应吸头。4.312孔道200μL可调式移液器及吸头。4.4酸度计。1 SN/T 1612-20054.5调温水浴锅或调温培养箱。4.6ELISA洗板机(可选）。4.7 酶标仪。4.8样品榨汁设备(微量样品榨汁机或者研钵等）。4.9 量筒(10 mL,20 mL、50 mL、100 mL、500 mL、1 000 mL 各一个)。4.10分析天平精度1/10000g。4.11试剂瓶(10 mL、50 mL、100 mL、500 mL、1 000 mL 各两个)。4.12封口膜 Parafilm。4.13吸水纸。5 试剂、溶液及生物制剂本标准中所有化学试剂的纯度除特别说明外均为分析纯。实验用水至少是蒸馏水。5. 110 × PBS 磷酸盐缓冲液81.8 g氯化钠(NaCl)氯化钾(KCI)1. 49 g磷酸二氢钾(KH2PO,)2.72 g14.2 g磷酸氢二钠(Na² HPO· 2H²O)加水定容至 1 L。5. 2PBS 磷酸盐缓冲液10 × PBS100 mL水850 mL调节 pH 至 7. 4 后再用水定容至 1 L。5. 3PBST 洗板缓冲液在 PBS 中加人Tween-20，使 Tween-20 的浓度为 0.1%（体积比）。5. 4 SEB 样品抽提缓冲液在 PBS 中加人以下试剂配制 SEBPVP(浓度为 2%,PVP郎聚乙烯吡咯烷酮)卵清蛋白(浓度为0.2%)Tween-20(终浓度为 0.05%)NaN:（使其终浓度为0.05%）。5. 5 CB 包被缓冲液碳酸钠(NazCO,)1. 59 g碳酸氢钠(NaHCO;）2.94 g叠氮化钠(NaN:）0.50 g水(HzO)900 mL调节 pH 至 9. 6 后再用水定容至 1 L。5.6 ELISA 底物5. 6. 1 底物缓冲液用水将二乙醇胺配制成10%浓度（体积比），pH值无须调整。5.6.2 底物用 10%二乙醇胺溶液将对硝基苯磷酸配制成 1 mg/mL 的浓度(现配现用)。5.7 抗体 IgG纯化的香石竹环斑病毒抗体 IgG，使用国内外正式注册的商品，根据供应商的说明用包被缓冲液稀2 SN/T 1612—2005释为工作浓度。5.8 酶标抗体碱性磷酸酶标记的香石竹环斑病毒抗体,使用国内外正式注册的商品，用 SEB稀释为工作浓度。6 样品制备6. 1 阳性对照样品香石竹环斑病毒的纯病毒或