SN_T 3746-2013百合枯萎病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3746-2013百合枯萎病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Fusarium oxysporum f.sp.lilii2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3746—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市农业科学院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。本标准主要起草人：戚龙君、宋绍祎、戴富明、曾蓉、杨翠云、王宏毅。- SN/T3746—2013百合枯萎病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了百合枯萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于百合鳞球茎中携带的百合枯萎病菌的检疫鉴定。2病菌基本信息中文名：百合枯菱病菌英文名：lilyfusariumwilt学名:Fusarium orysporum f.sp.lilii Snyg分类地位：无性阶段属于：真菌界（KingdomFungi），半知菌亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hyphomycetes），瘤座孢目（Tuberculariales)，瘤座孢科（Tuberculariaceae），镰刀菌属（Fusarium）。未见有性阶段。传播途径：主要有：a）土壤传播，土壤带菌传播是该病原菌传播的主要途径之一；b）种球传病，带病的种球通过买卖、运输等途径传播病害；c）残体带菌，病球的残体存在大量病原菌，在土壤中能长期存活，在再次种植过程中，能传播病菌百合枯萎病菌的其他信息参见附录A。3方法原理本标准根据该病菌在百合鳞茎球上的主要危害症状特征、形态学特征以及PCR反应特性为鉴定百合枯萎病菌的依据。4仪器和用具4.1主要仪器与用具超净工作台、生化培养箱、生物显微镜、生物体视显微镜、PCR仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外透射仪、凝胶成像系统、研钵和研棒、天平（感量0.0001g)、白磁盘和尖头镊子、pH计、塑料袋、离心管等。4.2主要试剂和培养基次氯酸钠、Tris-HCI、氯化钠、EDTA、三氯甲烷、异戊醇、4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、溴化乙锭(EB)、RNase酶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、异丙醇、巯基乙醇、溴酚蓝、CTAB、Taq酶等。PSA培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL）。5病原菌鉴定5.1症状检查根据百合枯菱病在百合鳞球茎上的特有症状特点，在光线充足处，对于抽取的样品逐个检查块茎表1 SN/T3746—2013面是否有典型的病斑，将有典型病症以及有怀疑症状的鳞球茎做进一步的分离和病原菌检疫鉴定。5.2病菌分离、纯化及形态观察鳞球茎表面具有典型病斑的：可将块茎在流水下冲洗去除表面的杂物后，表面用1%的次氯酸钠消毒3min～5min，无菌水冲洗2～3次，切下病健交界处的小块组织（3mm厚直径1cm），置于PSA上，24℃～26℃下分离培养，3d～7d后在体视显微镜下观察。出现菌落后，将菌落的边缘或分生孢子转移到PSA上继续纯化培养，产孢后进行形态鉴定（病原菌图片参见附录B）。5.3菌丝的PCR检测在PSA培养基上25℃培养获得的菌丝可直接进行PCR检测，检测方法见附录C5.4鳞球茎上病原菌的PCR和巢式PCR检测对于没有典型病斑的鳞球茎，可直接进行PCR和巢式PCR检测，检测方法见附录D。6鉴定特征6.1菌落特征和病菌形态病菌在PSA上气生菌丝绒状，洁白丰厚，培养中后期培养物正面或者背面可见牵牛紫色。产孢细胞短，简单瓶梗。小型分生孢子数量多，卵圆形或者椭圆型，0隔～1隔，但多数无分隔，大小在（4.2μm~11.1μm）×（1.5μm～3.6μm）之间。大型分生孢子组型美丽，月芽形，稍弯，向两端比较均匀变尖，一般3隔～5隔，多数3隔，大小为（12.3μm～48.3um）×（2.0μm～6.0μm）。厚垣孢子多为球形，直径为8.0μm~15.0μm，间生或顶生。未见有性阶段。6.2PCR和巢式PCR检测百合枯萎病菌培养菌丝的PCR检测：PCR产物在343bp处有特异性条带；鳞球茎中病菌的巢式PCR检测：在343bp和326bp处有特异性条带。7结果判定如症状检查、分离物培养性状与6.1相符合，且其菌丝基因组DNA经6.2的PCR检测在343bp有特异性条带，而阳性对照也在343bp有特异性条带、阴性对照在343bp无特异性条带，可判定该菌株为百合枯萎病菌；如阳性对照在343bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp处无特异性条带，则为非百合枯菱病菌。对鳞茎球的巢式PCR检测，在343bp和326bp处有特