SN_T 3888-2014入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌快速检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3888--2014入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌快速检测方法Rapid detection of Yersinia pestis from entry-exit animal skins2014-08-01实施2014-01-13发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局谐 SN/T 3888—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：乔舜、魏怀波、田丽、葛润平、郭文霞、王东胜、郝广福、张胜。I SN/T 3888--2014入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌快速检测方法1范围本标准规定了人出境动物皮张携带鼠疫杆菌的样本采样、保存及反相间接血凝试验和聚合酶链反应试验的快速检测方法。本标准适用于人出境旱獭、狐狸、狼、翁、鼠;灰鼠等可能感染鼠疫杆菌的动物皮张及寄生物的病原体检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。‘凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS 279鼠疫诊断标准国务院令第424号病原微生物实验室生物安全管理条例3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.13.动物皮张‧animal skins可能携带鼠疫杆菌的旱獭皮狐狸皮.狼皮、猪皮、麝鼠波灰鼠皮等。4实验室条件及防护要求4.1准则检测标本的处理和保存应在 BSL-2级以上实验室中进行。BSL-2级以上实验室的要求要符合GB19489和《病原微生物实验室生物安全管理条例》中同级别实验室的要求，并按照以上两个文件的要求来进行个人防护。检测方法主要参考 WS 279。4.2个人防护采用实验室二级防护标准。4.3实验仪器设备生物安全柜、DNA扩增仪、凝胶成像分析系统、电泳仪、高压灭菌器、电子天平、水浴锅、恒温箱、V孔板、移液器、不锈钢剪刀、打孔器。1 SN/T 3888—20145样本的采集和保存5.1梳检寄生物在大白盆内（或 1 m×1 m 的白布单)梳检寄生物，将检到的寄生物置于样品管内保存。5.2取样部位选择待检皮张的头颈部、尾部、四肢各个部位，有血液、淋巴结附着部位优先采样。5.3取样方法每张皮张按头颈部、四肢、尾部不同部位分别取1cm²大小的样本6块，用10cm×15cm塑料封口袋保存；血渍、淋巴结的部位用刀片刮取血渍，于10 mL带盖离心管内保存。5.4样本存放采集到的样本放置于一20℃冰柜或低温冰箱中冷冻保存,待检。5.5样本处理5.5.1反相间接血凝试验（Reverse indirect hemagglutination assay，RIHA)样品处理方法粉碎样本，加生理盐水浸没，浸泡24h。吸取浸泡液1500r/min离心5min，吸取上清液，56℃灭活 30 min后制成样液，备检。5.5.2聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)试验样本处理方法取1g龙胆紫，先用2mL酒精溶解后，加蒸馏水至100 mL，混匀，取此溶液10mL加人90mL蒸馏水制备成1g/L龙胆紫液;取2gNaCl加人100mL蒸馏水中,取此液100 mL加人1g/L龙胆紫液0.5mL，混匀后，分装高压灭菌30 min，配制成洗蚤液备用。粉碎样本，用双蒸水浸没，浸泡24h。吸取浸泡液1500r/min离心5min，吸取上清液，56℃灭活30 min后制成样液，备检；蚤、蜱、螨等寄生物样本置于研蚤板U孔内，用洗蚤液反复清洗干净，弃去清洗液，研磨后用生理盐水按照100 μL/只蚤（螨）、500μL/只蜱比例制成悬液，1500 r/min离心5min，吸取上清液，56℃灭活30min后制成样液，备检。6检测方法6.1反相间接血凝试验(RIHA)6.1.1试剂1%鼠疫F1抗体致敏血球。抑制剂为1：100稀释的鼠疫免疫血清。阳性对照血清：阴性混合血清加F1抗原至1mg/mL,1：100稀释后作为阳性对照。6.1.2标本准备按照5.5.1准备标本。2 SN/T 388820146.1.3初筛试验操作步骤每份被检液在V型孔微量血凝板稀释5孔。用移液器向每孔分别加人25μL稀释液。在第1孔中加入被检液25μL，吸排4次～6次，充分混匀，取25μL移至第2孔，充分混匀，依次稀释至最后一孔，弃掉 25 uL分别在各孔内加人1%鼠疫F1抗体致敏血球25μL，振荡混匀。置 37℃温箱或室温2h后观察结果。6.1.4结果判定“#”：凝集血球铺满孔低，有明显折边，抗体过量时，凝集呈疏松花圈状。“十十十”:凝集血球铺满孔低，