SN_T 2557-2010畜肉食品中牛成份定性检测方法 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2557—2010畜肉食品中牛成分定性检测方法实时荧光PCR法Detection of qualitation of bovine ingredient in meat product-Real time PCR method2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局敏码防 SN/T 2557—2010前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：吴亚君、陈颖、王斌、袁飞、杨海荣、黄文胜、赵贵明。 SN/T2557—2010畜肉食品中牛成分定性检测方法实时荧光PCR法1范围本标准规定了畜肉食品中牛成分检测方法本标适用于新鲜、冰冻畜肉和肉干、肉酱、酱肉、火腿、肉松等畜肉加工食品中牛成分定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T15481检测和校准实验室能力的通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3定义、术语和缩略语下列定义、术语和缩路语适用午本文独3.1定义和术语3.1.1实时荧光PCRRreal timePCR在PCR反应体系中加人特解性的荧光探针。该探针-寡核酸，与靶序列互补，两端分别标记~个报告荧光基团和一个淬灭荧戏基团。PCR扩增时，Tq酶的*3°外切酶活性将探针酶切降解。使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧将蓝测系统可接败到荧光信号。利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.1.2Ct值cyclethresholdvalue每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数。3.2缩略语3. 2.1CTABhexadecyltrimethyl ammonium bromide十六烷基三甲基溴化铵。3.2.2DNA deoxyribonuleic acid脱氧核糖核酸。 SN/T2557—20103.2.3dATPdeoxyadenosine triphosphate脱氧腺苷三磷酸。3.2.4dCrP deoxycytidine triphosphate脱氧胞苷三磷酸。3.2.5dGTP deoxyguanosine triphosphate脱氧鸟苷三磷酸。3.2.6dTTP deoxythymidine triphosphate脱氧胸苷三磷酸。3.2.7dUTP deoxyuridine 1riplhosphate脱氧尿苷三磷酸。3.2.8EDTAethylene diaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸。3.2.9ROX carboxy-X-rhodamine羧基-X-罗丹明。3.2.10Taq Thermus aquaticu水生栖热菌。3.2.11TAMRA carboxy-tetramethyi-rhodamine羧基四甲基罗丹明。3.2.12Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷。3.2.13UNG酶uracil-N-glycosylase尿嘧啶DNA-糖基化酶。防止污染措施4防止污染措施应符合GB/T27403的规定。5试样制备与保存5.1试样制备从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分出不少于500名作为试样。装入清洁容器中，加封后，标明标记。2 SN/T2557—20105.2试样保存将试样于一20℃冷冻保存。6测定方法6.1原理对样品进行DNA提取：使之适用于PCR检测技术，通过实时荧光PCR，检测其中是否含有牛特异性基因序列，达到对食品中牛成分定性PCR检测的目的。6.2主要仪器6.2.1实时荧光PCR仪。6.2.2恒温水浴锅。6.2.3离心机：离心力不小于12000g。6.2.4微量移液器：0.5μL~10μl,10μL~100μl,20μL~200μL,200μL~1000μL。6.2.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.2.6 pH计。6.2.7天平：感量0.01g。6.3生要试剂除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T15481的规定。6.3.13实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2琼脂糖。6.3.3CTAB提取缓冲液：CTAB20g/L，氯化钠1.4mol/L，Tris0.1mol/L,Na²EDTA2