SN_T 1135.9-2010马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1135.9—2010马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al11-01 发布2011-05-01实施1uo中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局教码防 SN/T 1135.9-2010前言SN/T1135标准分为以下部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法；-马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法;-马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；马铃薯腐病菌检疫鉴定方法；马铃薯 A病毒检疫鉴定方法；马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法;马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第9部分。本标准按照GB/T 1.1一2009 给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局和中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局。本部分主要起草人：易建平、周国梁、印丽萍、王有福、于恒纯。 SN/T 1135.9--2010马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法1范围SN/T1135的本部分规定了进出境植物检疫中马铃薯青枯病菌 Ralstonia solanacearum race 3biovar 2 的检测和鉴定方法。本部分适用于进出境马铃薯块茎及其产品、番茄种苗及其产品和天竺葵种苗及其产品中马铃薯青枯病菌的检测和鉴定。2#规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法进出境植物苗术检疫规程SN/T 1157SN/T 1193基因检验实验室技术要求进出境植物种检疫规程SN/T 1809SN/T 2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理earum race 3 biovar 2属细菌域 Bacteria,变形菌门 Proteobacteria,β变马铃薯青枯病菌 R.solanc形菌纲Betaproteobacteria，伯克氏菌目’Burkholderiales，伯克氏菌科Burkholderiaceae，劳尔氏菌属Ralstonia。马铃薯青枯病菌的分布、寄主范围、为害症状和生理生化特性等相关信息参见附录 A。根据青枯病菌对不同寄主植物的致病性差异,青枯菌划分为5个小种(参见附录 B)，马铃薯青枯病菌属于3号小种，主要侵染马铃薯和番茄。根据青枯病菌对三种双糖(麦芽糖、乳糖和纤维二糖)和三种乙醇（甘露醇、山梨醇和卫矛醇)氧化产酸能力的差异将青枯菌分为 4个生物型(参见附录B)，马铃薯青枯病菌属于生物型2（只能氧化3种双糖，不能氧化3,种乙醇）。马铃薯青枯病菌的形态特征、生物学特性、致病性反应以及分子生物学特征作为制定本检疫鉴定标准的依据。4仪器设备和用具超净工作台、高压灭菌锅、生物培养箱、电子天平、冰箱、离心机、水浴锅、培养血、三角瓶、剪刀、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管。5药品试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。蛋白陈、甘油、硫酸镁、磷酸氢二钾、琼脂、Taq DNA 聚合酶、溴化乙锭（EB)、琼脂糖和 DNAMarker。SMSA 培养基配方见附录 C,ELISA 试验所需药品试剂见附录 D,PCR 试验和实时荧光 PCR试验所需药品试剂见附录E。 SN/T 1135.9—20106检测鉴定6.1 检测鉴定流程马铃薯青枯病菌的检测鉴定流程图如图1所示。无症样品有症样品观察喷菌现象ELISA或PCR检测SMSA分离TZC分离典型可疑菌落未发现典型菌落BIOLOG或PCR或小种生物型区分试验致病性测定未检测马铃薯青枯检测马铃薯青枯菌图1马铃薯青枯病菌的检测鉴定流程图6.2　初筛按照SN/T1157、SN/T1809和SN/T2122中规定的程序进行现场检疫并抽取样品。实验室内对样品进行症状检查，马铃薯块茎可以通过切开块茎来检查内部症状。如检查发现茎剖面维管束变色等典型症状(参见附录 A）,取样品病健交界处进行病菌分离；未发现典型症状的样品，用 ELISA（见附录 D)或 PCR(见附录E)方法进行初筛检测。经初筛检测,阳性样品进行病菌分离。6.3　分离具有典型症状的样品在显微镜下观察有无喷菌现象,取植物组织于灭菌水中，可以看到云雾状细菌从切口处喷出。取典型症状样品病健交界处组织或初筛阳性样品组织少许于 1 mL～5 mL灭菌水中，静置 15 min～30 min,让细菌从染病组织中游离