SN_T 3560-2013国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3560—2013国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR 检测方法Detecting method for Yellow fever virus, Dengue virus,Chikungunya virus, WestNile virus by multiplex real-time fluorescence RT-PCR at frontier ports2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局真 SN/T 3560—2013#言前本标准按照GB/T 1.1一2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：田桢干、郑夔、李强、孙立新、黄吉城、章琪、李平、曹敏、贾巍、何宇平、张显光、卢钟山。1 SN/T 3560—2013国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸黄热病毒,登革病毒基孔肯雅病毒西尼罗病毒的多重实时荧光 RT-PCR检测方法检验的对象、检测方法、程序及结果报告。.本标准适用于国境口岸人出境人战蚊类携带黄热病毒登革病毒、塞乳孔肯雅病毒、西尼罗病毒的实验室快速筛查检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最薪版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室‧生物安全通用要求、WS/T 230临床诊断中聚合酶键反PCR)技本的应用3缩略语下列缩略语适用于本文件。-聚合酶链反应实时荧光RT-PCR：实时荧光凤转录-Ct值：每个反应管内的荧光信鲁达到设定的阈值时所经历的循环数FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团HEX:HEX荧光染料，一种荧光报告基闭Texas Red:Texas Red 荧光染料种荧光报告基团CY5:CY5荧光染料，种荧光报皆基团BHQ:黑洞淬灭基团LNA:锁核苷酸4　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。4.1黄热病毒Yellow fever virus属于黄病毒科黄病毒属成员，为 RNA病毒，是引起人类黄热病的病原体。传播媒介为蚊虫。4. 2登革病毒·Dengue virus属黄病毒科黄病毒属,包括I、Ⅱ、IⅡ、IV四种血清型,是有包膜的单股正链 RNA 病毒。登革病毒1 SN/T 3560—2013可感染人，并引起登革热，严重者甚至可引起登革出血热或登革休克综合症。埃及伊蚊和白纹伊蚊是登革病毒的主要传播媒介。4.3基孔肯雅病毒Chikungunya virus披膜病毒科甲病毒属的第四组，核心含单股RNA。人体感染该病毒后，可以引起基孔肯雅热，该病起病快，传播范围广。我国南方广泛存在的白纹伊蚊是其主要的传播媒介。4. 4西尼罗病毒 West Nile virus黄病毒科黄病毒属的重要成员，其基因组为单股正链RNA分子。西尼罗病毒可感染人，引起西尼罗热。库蚊是西尼罗热病毒的主要传播媒介。在欧洲和北美为尖音库蚊，在亚洲则为三带喙库蚊和致倦库蚊。5仪器和设备需要如下仪器、设备：含FAM、HEX、Texas Red、CY5四种荧光检测通道的实时荧光PCR仪；一生物安全柜；-普通冰箱；-70℃超低温冰箱；普通台式离心机；一高速冷冻离心机（转速可达20000g）；一-微量可调移液器(10 μL、100 μL、1000μL)及配套带滤芯吸头;离心管(1.5 mL);一涡旋器。6 检测对象6.1人出境口岸疑似携带黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的媒介蚊虫。6.2人出境口岸疑似感染黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的人员。7 检测7.1准备实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230的要求。7.2实验室检测7.2.1标本的采集、运输和保存7.2. 1. 1 人血清标本无菌采集发病后 5d内静脉血 3 mL～5 mL，室温静置30 min 使其凝固，然后 500 g离心10 min，去除纤维蛋白和红血球，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，于4℃送样箱中尽快送到实验室检测，或一70℃以下保存待检。2 SN/T 3560--20蚊子标本根据实际工作需要采集蚊子标本。将采集的蚊子直接放人一20℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按30只-一份。装人2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，于一70℃以下运输或保存待检。7.2.2 标本的处理7.2.2. 1 血清标本的处理血