SN_T 2563-2010肉及肉制品中常见致病菌检测 MPCR-DHPLC法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2563—2010肉及肉制品中常见致病菌检测MPCR-DHPLC 法Detection of pathogenic Bacteria in meat and meat products-MPCR-DHPLC2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2563—2010前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：郑秋月、曹际娟、徐君怡、于兵、李苏龙、齐震玉、孙哲平、王刚、王金玲、王秋艳、徐杨、耿丽梅、高小博。 SN/T2563—2010肉及肉制品中常见致病菌检测MPCR-DHPLC 法1范围本标准规定了肉及肉制品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、溶血链球菌6种常见致病菌的MPCR-DHPLC检测方法。本标准适用于肉及肉制品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、溶血链球菌6种常见致病菌的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。沙门氏菌检验GB/T4789.4食品卫生微生物检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB/T 4789.8食品卫生微生物检验空肠弯曲菌检验GB/T 4789.9食品卫生微生物检验·“金黄色葡萄球菌检验GB/T 4789.10食品卫生微生物检验溶血性链球菌检验GB/T 4789.11食品卫生微生物检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T 4789.30食品卫生微生物检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验SN/T0184.1进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。3. 1PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应。3.2MPCR multiplex PCR多重PCR。3.3DHPLC denaturing high performance liquid chromatography变性高效液相色谱。3.4TEAA三乙基铵乙酸盐。 SN/T 2563—20104生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489的有关规定执行。5废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施按GB/T27403规定执行。6原理多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液（TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。7试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。7.1TagDNA聚合酶7.2dNTP:dATP、dTTP,dCTP、dGTP。7.310XPCR缓冲液:200mmol/LTris-HCl(pH8.4)，200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。7.4引物：引物序列见附录A表A.1。7.5TE溶液。7.6 10% SDS.7.7至蛋白酶K(20mg/mL)。7.8复氯化钠溶液（NaCl）：5mol/L和0.7-mol/L。7.9 10% CTAB.7. 10三氯甲烷。7. 11异戊醇。酚。7. 127.13异丙醇。7.1470%乙醇。7.15DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50mLTEAA和250μL乙混合，加水定容至1000mL;缓冲溶液B为50mLTEAA和250mL乙腈混合，加水定容至1000mL缓冲溶液D为-75%乙腈。8主要仪器和设备8.1 PCR仪。2 SN/T 2563—20108.2 DHPLC 仪。高速离心机：离心转速18000g。8.38.4PCR超净工作台。8.5微