SN 1110-2002新城疫病毒分离及鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1110—2002新城疫病毒分离及鉴定方法Procedure of virus.isolation and identificationfor Newcastle disease2002~05-20 发布2002-11-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1110—2002前 言本标准等效采用国际兽医局的标准《诊断方法和疫苗标准手册》（2000年，第四版），并参考农业部《新城疫检疫技术规范》，结合我们的操作经验编写、制定。本标准的附录 A、附录 B均为标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准起草人：单松华、胡永强。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准新城疫病毒分离及鉴定方法SN/T 1110 2002Procedure of virus isolation andidentification for Newcastle disease1 范围本标准规定了离类新城疫病毒(NDV)分离及鉴定方法。本标推适用于禽类新城疫病毒的分离及鉴定。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修改，使用本标准的各方应探讨使用下列标准必威体育精装版版本的可能性。国际兽疫局《诊断方法和疫苗标准手册》（2000年，第四版）3材料准备所用试剂均为分析纯。3.1普通天平、分析天平、普通离心机、V型血凝板、微型振荡器、50μL可调移液器、恒温箱、超净工作台、塑料采血管等。3.2抗生素：青霉素、链霍素、庆大素和制菌霉素等。3.3 9～11 日龄无特定病原体(SPF)鸡胚、1 日龄 SPF 鸡和 6周龄SPF鸡。3.4 pH7.0 或至 pH7.40.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(见附录 A 标准的附录)。3.5阿氏液(红细胞保存液)的配制(见附录 B标准的附录)。3.61%鸡红细胞：采集SPF鸡或无新城疫血凝抑制抗体的成年鸡血，放入等量的阿氏液中，用 20倍体积的 PBS 洗涤 3～4 次，每次以 2 000 r /min 离心(3～4)min，最后一次 5 min，用 PBS 配成 1%悬液。4℃保存悬液，在72 h内使用完。3.7拭子准备：将脱脂棉缠于牙签的钝端，使其形成直径0.4cm的脱脂棉球，然后用牛皮纸包扎，每捆10只，121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。或直接购买商品用拭子。3.8标准新城疫病毒、标准阳性血清：由指定单位供应。4样品采集和制备4.1样品采集4.1.1活禽采集气管拭子和泄殖腔拭子（沾有粪便）；雏禽采集新鲜粪便。4.1.2死禽采集口鼻拭子、肺、肾、肠（含内容物）、脾、脑、肝、心等组织，样品可单独采集或者混合，肠内容物常需单独处理。4.1.3 病程长的 ND 病鸡或非典型 ND 病例可采集骨髓。4.1.4将无菌采集的样品装人灭菌的小瓶中，并标记清楚（编号、采样时间），样品立即送实验室处理或于30℃冷冻保存。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-05-20批准2002-11-01 实施1 SN/T 1110 -20024.2样品制备4.2.1取采集样品置于研磨器中磨碎，加入PBS制成10%～20%(W/V)的悬液；采集的拭子浸人(2~～3)mLPBS中，充分振荡，反复挤压,弃去拭子。4.2.2 在不超过 25℃的室温下,1 000 r/m 离心(10~15)min 。4.2.3上清液加入抗生素。使用何种抗生素视具体情况而定，常使用的抗生素终浓度为：青霉素（2000IU/mL），链霖素（2 mg/mL），庆大素（50 μg/mL)和制菌群素（1 000 IU/mg）;粪便和泄殖腔拭子样品，抗生素量提高5倍。加人抗生素后用 0.2mol/L磷酸氢二钠(见附录 A1.1)调节pH至 7.0～7.4。4℃作用 4 h或过夜，或室温作用（1~2）h，或37℃作用30 min，以确保无菌。或上清液经 0.45 μm 滤膜过滤除菌。或上清液5000r/m离心10min后，移出上清液，再8000r/m离心10min，取上清液进行下一项试验。4.2.4 上述除菌液应尽快进行试验。如没有条件，可在一30℃冷冻保存。5 操作方法5.1 病毒分离培养5.1.1细菌污染检查将上述除菌液接种于灭菌的普通营养琼脂平板上，37℃培养24h，检查有无细菌生长。当有细菌生长时，应按4.2.3法，进一步作无菌处理。5. 1.2 鸡胚接种用 1 mL 注射器吸取上述除菌液,经尿囊腔接种至少 5 枚 9~11 日龄 SPF 鸡胚,每胚 0. 2 mL,置于(35~37)℃孵育 4~～7 d