SN_T 1698-2010伪狂犬病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1698—2010代替SN/T1698—2006伪狂犬病检疫规范Quarantine protocol for Aujeszkys disease2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国303发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T1698—2010創言前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替了SN/T1698一2006《猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程》。本标准与SN/T1698—2006相比，主要技术变化如下：本标准中第4章引用了GB/T18641一2002《伪狂犬病诊断技术》中第3章的内容；修改采用了GB/T18641-2002《伪狂犬病诊断技术》中第2、4、7章的内容；本标准中第7章代替了《猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程》（SN/T1698一2006）。本标准修改采用OIE《陆生动物诊断试验与疫苗手册》(2008)中第2.1.2章制定，修改了病毒分离、PCR、血清中和试验的操作规程，增加了兔体接种试验、鉴别诊断ELISA方法、乳胶凝集试验、免疫荧光试验的操作规程。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吕建强、卢体康、花群义、林志雄、张常印、姜焱、秦智锋、曹琛福、张彩虹、陶虹、阮周曦、田纯见。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1698—2006。 SN/T 1698—2010伪狂犬病检疫规范1范围本标准规定了伪狂犬病的病毒分离鉴定、聚合酶链式反应、兔体接种试验、血清中和试验、酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验及免疫荧光试验的检疫技术规范本标准适用于进出境猪、羊、牛、犬、猫及其他易感动物伪狂犬病的检疫和诊断。22规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18641—2002伪狂犬病诊断技术33病毒分离鉴定3.1试验材料及设备DMEM培养液、细胞生长液、细胞维持液配方见附录A，猪肾细胞系细胞（PK-15)或仓鼠肾细胞（BHK21）、新生特牛血清、青霉素、链霉素、0.22μm微孔滤膜、细胞培养瓶、37℃恒温培养箱等。3.2操作方法3.2.1样品采集用于病毒分离的样品可以是活猪的口咽液、鼻液（拭子)或扁桃体活组织，或来源于死亡猪或表现临床症状猪的样本，其中脑和扁桃体样本是首选。对于潜伏感染的猪，三叉神经节是分离病毒最合适的部位。牛感染该病的特征通常是搔痒，可以采集脊索的相应部位作为样本。3.2.2样品处理在含抗生素（例如200IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的细胞培养液或常规缓冲液中对以上样品进行匀浆处理，样品与液体的比例为1：5，反复冻融3次后3000r/min低速离心10min获得上清液，经0.22um微孔滤膜过滤，然后利用其接种任何对伪狂犬病毒敏感的细胞培养系统。如果不立即接种细胞分离病毒，可以将其置于一70℃保存作为接种材料。3.2.3接种细胞分离该病毒常使用猪肾细胞系（PK-15)，接种前采用细胞生长液培养细胞，接种后使用的细胞维持液应该含有抗生素，例如200IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。将样品滤液接种到已长成单层的PK-15细胞上，接种量为最终培养维持液的10%，37℃恒温培养箱中吸附1h，然后加人DMEM培养维持液，置于37℃恒温培养箱中培养，逐日观察。1 SN/T1698—20103.3观察结果通常伪狂犬病毒诱导产生的细胞病变效应(CPE)出现在接种后的24h～72h内，因此用于接种的细胞培养物应维持5d~6d。当接种样品滤液后出现CPE时，表现为细胞变圆、聚集，成网状、细胞层脱落，有时形成合胞体。在没有明显CPE时，应盲传三代，如仍然无CPE出现，则伪狂犬病毒分离检测为阴性。3.4病毒鉴定对于出现CPE的细胞培养物进行病毒鉴定，可以采用病毒中和试验、免疫荧光试验或聚合酶链式反应，出现阳性结果即可判定为伪狂犬病毒分离鉴定阳性4聚合酶链式反应(PCR）按照GB/T18641一2002中的操作方法进行5兔体接种试验5.1试验动物选择健康成年家兔，经血清中和试验、乳胶凝集试验、琼脂扩散试验或酶联免疫吸附试验检测，证实为伪狂犬病抗体阴性。5.2样品处理无菌采集疑为该病死亡或扑杀动物的脑组织、扁桃体、淋巴结，混合后剪碎，用组织匀浆器研磨，用灭菌生理盐水配成1：5乳悬液反复冻融3次后，以3000r/min离心10min，取上清液加人青霉素和链霉素溶液，最终浓度分别为200IU/mL和100μg/mL，置4℃冰