SN 1155-2002玉米霜霉病菌检疫鉴定方法.pdf

S中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1155--2002植物检疫玉米霜霉病菌检疫鉴定方法Plant quarantine-Methods for quarantineand identification of Peronosclerospora (Ito) C. G. Shaw200２-11-25发布2003-05-0１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1155-2002次目前言1范围2原理3仪器和用具4试剂和材料5现场检疫与取样6实验室检验7结果评定++8样品保存附录A(资料性附录）玉米霜霉病菌寄主范围身量-附录 B(资料性附录)DNA提取、扩增与电泳·附录C(规范性附录)PCR扩增引物....O附录D(资料性附录），玉米霜篝病菌卵孢子、分生孢子、分生孢子梗图10 SN/T 1155—2002前言本标准的附录 C为规范性附录,附录 A、附录 B、附录 D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局本标准主要起草人：李德福、郭琼霞、陈艳、张广志、张晓燕。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1 SN/T 1155--2002植物检疫玉米霜霉病菌检疫鉴定方法1范围本标规定了植物检疫中玉米霜病菌检疫和鉴定方法。本标准适用于玉米、甘蔗、高梁及其他寄主中玉米霜霉病菌的检疫和鉴定。2原理玉米霜霉病主要由高粱霜霖病蘭（Peronosclerospora sorghi）、甘蔗霜病菌（P.sacchari）、菲律宾霜霉病菌（P.philippinensis）和爪哇霜霖病菌（P.maydis)引起，该类病菌（以下简称玉米霜霉病菌Peronosclerospora spp.）属鞭毛菌亚门（Mastigomycotina)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霏目（Peronospora-les）、霜科(Peronosporaceae)、霸指属（Peronosclerospora）。玉米霜霉病菌除危害玉米外，还侵染其他植物（参见附录A）。一般情况下玉米霜病菌引起系统性侵染，有时也引起屌部侵染，受侵染的玉米叶片出现边界明显的失绿，后期形成褐色坏死条斑。在温度17℃～29℃、环境湿润条件下，叶背面病斑长出一层白色状物，即玉米霜病菌分生孢子和孢子梗。该病菌分生孢子及孢子梗形态、分生孢子萌发情况、卵孢子形成情况、PCR特异性反应等特征是玉米霜霉病菌鉴定特征。3仪器和用具3. 1显微镜、体视显微镜。3.2 PCR 仪、电泳仪。3.3冷冻高速离心机、台式微量离心机。3.4普通冰箱、低温冰箱、恒温恒湿培养箱。3.5普通天平（感量为1/100)。3.6超净工作台。3.7可调微量加样器。3.8 Eppendorf 管(1. 5 mL、0. 5 ml),Oak Ridge 离心管(30 mL)。3.9镊子、腐头牙签。3. 10载玻片、盖玻片、培养Ⅲ（直径为15 cm～20 cm）。3.11钅铝铂纸或Parafilm膜。4试剂和材料4.1 三(羟甲基)氮基甲烷(CHnNO),)4.2 乙二胺四乙酸(ClHi2N2O:)4.3 十二烷基硫酸钠[(CH²)12OSO,Na]4. 4 2-巯基乙醇(C,H:OS)4.5 异丙醇(C,H:O)4. 6 异戊醇(C,H1oO)4.7 乙醇(CH:CH2OH)4. 8 溴酚蓝(Cig HioO; Br,S)1 SN/T 1155--20024.9苯胺蓝(CsHzsN，·HCI)4. 10 甘油(CH,OH ·CHOH - CH,OH)4.11 二甲苯苯胺(C:H.N)4. 12 苯(C.Hs)4.13乙酸钠(CH;COONa)醋酸钾(CH:COOK)4. 144. 15三氯甲烷(CHCI)4.16氯化钠(NaCI)4. 17氯化钾(KCI)4.18氯化镁（MgCl2）氢氧化钠(NaOH)4. 194种脱氧核苷三磷酸(dNTP)4.204.21Taq DNA聚合酶4.22核糖核酸酶 RNase A溴化乙锭(CH2Br·CH2Br)4.234.24矿物油4. 25吐温-204. 26琼脂粉4. 27液态氮(N2）4.28 1 kb DNA(浓度为 25 ng/μL)5现场检疫与取样5.1现场检疫现场核对货物有关单证，核实产地、包装、唛头、品名及数量。仔细检查进境玉米霜病菌寄主种子或原粮中是否夹带高梁、甘燕叶片病残体，是否夹带带颖壳的高粱种子，检查进境甘蔗插条和其他玉米霜霏病菌寄主种苗叶片是否有可疑病斑，将检获物一并带回实验室内检验。5.2原粮和种子取样5.2.1原始样品和复合样品制备船运散装进境的玉米霜霉病菌寄主种子或原粮，分船舱、分层次、分品种按棋盘式30个～50个点扦取原始样品，每份原始样品的质量应不少于50g；并制成复合样品，每份复合样