SN_T 1486-2016输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法.pdf

w中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1486—2016代替SN/T1486—2004输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法Detection of yellow fever virus in imported mosquitoes2016-10-01实施2016-03-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局打槟查真伪 SN/T 1486—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替 SN/T 1486一2004《输人性蚊类携带的黄热病毒检测方法》。本标准与 SN/T1486--2004相比主要技术变化如下：一修改了“1标准的范围”;修改和增加了“2规范性引用文件”；增加了术语和定义“RT-PCR反应”“荧光 RT-PCR反应”;增加了“4缩略语”；修改和增加了“5实验室生物安全要求”;将“5实验室生物安全要求”调整为“6生物安全措施”,并修改了表述内容;修改了结构和表述：划分了层次，分为“主要仪器和设备”“主要试剂”、“检验程序”；将“6.1.1器材”调整为“7仪器和设备”并修改了表述方式和内容；将“6.1.2常用试剂”调整为“8主要试剂”,并修改了表述方式和内容；-修改了内容和方法：将“6.2操作方法”调整为“9检验程序”并修改了表述；增加9.3“荧光一RT-PCR检测方法”;删除“病毒分离与酶联免疫吸附试验检测方法”;修改并增加了结果判定的细节：修改了“RT-PCR方法结果的判定”的表述；增加了“荧光RTPCR方法结果的判定”；增加了废弃物处理；-删除了附录 A。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张升、周冬根、吴薇、郑剑宁、杨天赐、崔科军、胡群。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1486—2004。I SN/T 1486—2016输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法1范围本标准规定了国境口岸输人性蚊类携带黄热病毒的检测对象、生物安全措施、仪器和设备、主要试剂、检验程序、阳性结果处置和废弃物的处理。本标准适用于输入性蚊类体内携带黄热病毒的实验室检验。口岸发现的蚊类携带黄热病毒检测可参考本标准执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1输入性蚊类imported mosquitoes通过人境交通工具、集装箱货物、行李及邮包等携带人境的蚊类。3.2黄热病毒 yellow fever virus属于黄病毒科（Flaviviridae)黄病毒属（Flauivirus）单股正链RNA病毒，与同属的登革热病毒等有交叉免疫反应。病毒颗粒为直径 37 nm～50 nm 的球形,外有脂蛋白包膜,包膜表面有刺突。基因组大小约为11kb，只含有一个长的开放阅读框架。3.3逆转录聚合酶链式反应 reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)将 RNA 的逆转录(RT)和 cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。本标准采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在 RT-PCR 中，首先以 RNA 为模板,利用下游特异性引物,在依赖 RNA 的DNA聚合酶（逆转录酶)的作用下转录合成互补 DNA（cDNA）,该步称作“逆转录”;随后,再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物,在 DNA 聚合酶的作用下进行 PCR 循环扩增；最终使 RNA 分子的某个特定区域（目的片段)被扩增达几百万倍。3.4荧光 RT-PCR 反应 fluorescence RT-PCR实时荧光 RT-PCR方法有多种,本标准采用的是 TaqMan 水解探针法，其原理是在常规 RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,利用 Taq 酶的5- SN/T 1486--20163外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。４缩略语下列缩略语适用于本文件bp base pair:碱基对。FAM 6-carboxy-fluorescein:6-羧基-荧光素，一种荧光报告基团。BHQ1 Black Hole Quencher-1:一种荧光灭基团。5 检测对象