SN_T 3584-2013草鱼出血病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3584—2013草鱼出血病检疫技术规范Quarantine protocol for hemorrhagic disease of grass carp2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布团国家质量监督检验检疫总局8话40 SN/T3584—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准参考了亚太地区水产养殖网络中心(NACA)的疾病诊断卡《Disease card》中的《草鱼出血病（Hemorrhagicdiseaseofgrass carp）》。采用了诊断卡中推荐的细胞培养分离、RT-PCR方法，具体细化了ELISA方法，并增加了直接通过电泳观察病毒核酸带的方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：江育林、梦芳、张永宁、王娜、张利峰、高隆英、景宏丽、唐连飞、张曼I SN/T3584—2013草鱼出血病检疫技术规范1范围本标准规定了草鱼出血病的实验室的检测方法。本标准适用于草鱼出血病病原的鉴定，用于流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T66822分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。CO：草鱼卵巢细胞系（Grass carpovarycell line)CIK：草鱼肾细胞系（Grasscarpkidneycellline）CPE：细胞病变效应（Cytopathiceffect)EB：溴化乙锭（Ethidiumbromide）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate)PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）ELISA：酶联免疫试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay)PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelctrophoresis）HEPES:N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acidTMB：四甲基联苯胺（3，3，5，5-Tetramethylbenzidine)OPD：邻苯二胺（O-PhenylenediamineDihydrochloride)SDS：十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate）4疾病概述草鱼出血病（Hemorrhagicdiseaseofgrasscarp）（参见附录A）主要感染当年草鱼种和青鱼，死亡率可达80%以上。其他淡水鲤科鱼，如鲢鱼、鱼、鲫鱼、鲤鱼感染后没有临床症状，但可以携带病毒到处传播。该病在水温高于20℃以上时流行，25℃～28℃为流行高峰。常见的临床症状为眼突出、体色发黑，口腔、鳃盖和鳍条基部出血。撕开表皮，可见肌肉出现点状或块状出血。剖检腹腔，可见肠道充血，肝、脾充血或因失血而发白。病原为草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV），是水生呼肠孤病毒属（Aquareouirus）的成员。病毒为直径70nm的球形颗粒，有双层衣壳，无囊膜，含有11个片段的双链RNA。根据片段长度大小分为大（L1、L2、L3，大小在4.0kb～3.7kb）、中（M4、M5、M6，大小在2.5kb～2.0kb）、小（S7、S8、S9、S10、S11,大小在1.6kb～1.0kb)三组。在不同地区存在抗原性、核酸电泳图谱、对细胞的敏感1 SN/T3584—2013性和对鱼的毒力都有一定差异的毒株。多年研究已经确定的有两个典型的代表株：GV-873为湖南株，能在CO、CIK等细胞中大量增殖并出现CPE，症状以内脏出血为主；GV-9014为湖北株，能在CIK、CO细胞中大量增殖，但不产生CPE，症状以肌肉出血为主。在核酸序列上GV-9014株和GV-873株的同源性不到81%。5设备和器材倒置显微镜、生化培养箱、普通冰箱、超低温冰箱、组织研磨器、离心机、离心管、超净工作台、PCR仪、电泳仪、微波炉、微量移液器及吸头、紫外观察灯（或者凝胶成像仪）、水浴锅、磁力搅拌器、酶标仪和洗板机。6试剂和材料6.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水要用DEPC处理以除掉RNA酶。6.2GCRV病毒（GV-873，阳性对照）：由国家指定机构提供。6.3羊抗GCRV免疫球蛋白（Ig），由国家指定机构提供6.4鼠抗GCRV的单克隆抗体，由国家指定机构提供6.55Tag