SNT 2330-2009化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2330--2009化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验Cosmetics embryotoxicity and developmental toxicity ofmice embryonic stem cell test2009-07-07 发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局皖1850161福数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验SN/T 2330—-2009*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230　1/16　印张 1.25　字数 32千字2009年11月第一版　2009年11月第一次印刷印数 1—2 000*书号：155066·2-19942 SN/T言本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D为资料性附录,附录 E为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中山大学。本标准主要起草人：程树军、项鹏、焦红、陈蕊、秦瑶、温巧玲、许崇辉、潘芳。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2330-2009化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验 范围本标准规定了化妆品胚胎和发育毒性小鼠胚胎干细胞试验的试验原理、试验准备、试验方法、结果和报告。本标准适用于化妆品原料/化学品潜在胚胎毒性的筛选和检测：本标准为胚胎和发育毒性的动物试验的替代方法之二，结合其他替代试验或动物试验用于化学物质毒性的整体评价。本标准也可供制药、农业、工业化学物质、食品添加剂和其他污染物胚胎和发育毒性试验的参考。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1胚胎干细胞embryonic stem cel:DS来源于胚胎内细胞团或原始生死细胞，能无限分裂并保持未分化状态，具有向胚胎三个胚层来源的所有细胞分化的能力。2.2胚胎体embryoid bodies,Ebs在体外培养环境中，胚胎干细胞培养体系中撤除抑制细胞分化的因子，胚胎干细胞就会失去保持未分化状态的能力，可以自发形成多细胞结构，即胚胎体，胚胎体中含有内层、中胚层和外胚层3个胚层的细胞。2.3分化 differentiation分化是一个过程。在分化的过程中,细胞内-些特定的基因开始表达，而其他基因并不表达，从而个非特化的细胞特化成为一个具有特殊结构并执行定功能的细胞，2.4 fibroblast成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起，细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。2. 5胚胎毒性 embryotoxicity外源性化学物直接或间接地作用于胚胎产生胚胎毒作用，表现为妊娠着床前早期或着床后阶段胚胎的自动丢失，如吸收、流产、死胎和整个胚胎或器官和系统生长发育迟缓等。2.6小鼠白血病抑制因子·mice leuckemia inhibitory factor,mLIF用于维持小鼠胚胎干细胞增殖和未分化的状态的一类生长因子。2. 7悬滴培养 hanging drop method用于诱导胚胎干细胞分化为胚胎体样结构的一种细胞培养方法，以观察细胞生长和发育过程。 SN/T 2330—20092.8半数抑制浓度IDso抑制ES细胞分化为心肌细胞50%的受试物浓度。2. 9胚胎干细胞半数致死浓度ICso ESES细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度。2.10成纤维细胞半数致死浓度IC5。3T33T3成纤维细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度。3试验原理胚胎毒性试验或用妊娠动物在体内进行，或用培养的胚胎以及来自妊娠动物的胚胎组织或细胞在体外进行。这几种体内和体外试验必须以牺牲动物为代价。本试验基于胚胎毒性作用中最重要的指标，即受试物对胚胎和成体组织的毒性损伤存在敏感性差异，这种差异与分化的抑制程度密切相关，胚胎干细胞(ES)对毒性物质的反应比成体细胞更为敏感。本试验采用两个永生化的小鼠细胞系：mES为小鼠胚胎干细胞，代表胚胎组织;3T3 为成纤维细胞，代表成体组织。mES细胞在白血病抑制因子（mLIF)存在的情况下能保持未分化状态，在适当条件下 ES细胞具有形成胚胎体和分化成主要的胚胎组织的能力。通过评价抑制胚胎干细胞分化的能力和抑制ES、3T3细胞生长的能力，预测受试物的潜在胚胎毒性。4试验材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，试剂最好选用进口试剂。4.1细胞4.1.1胎鼠成纤维细胞(Balb/3T3细胞）：来源于Balb/c小鼠，最好来源于美国标准生物品