SN_T 4733-2016小麦叶疫病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4733—2016小麦叶疫病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Alternaria triticina Prasada and Prabhu2016-12-12 发布2017-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局香立货 SN/T4733—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国新疆出人境检验检疫局，新疆生产建设兵团农业技术推广站。本标准起草人：张祥林、赵冰梅、王、张伟、张小菊、张瑜。一 SN/T4733—2016小麦叶疫病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了小麦叶疫病菌［AlternariatriticinaPrasadaPrabhu］的检疫鉴定方法。本标准适用于进境小麦种子、原粮及田间病株中小麦叶疫病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1809进出境植物种子检疫规程3小麦叶疫病菌基本信息学名：AlternariatritwinaPrasadaPrabhu英文名：leafblightofwheat分类地位：子囊菌门（Ascomycota）；座囊菌纲（Dothideomycetes）；格孢腔菌目（Pleosporales）；格孢腔菌科（Pleosporaceae）；链格孢属（Alternaria）。小麦叶疫病菌的其他相关信息参见附录A和附录B。4方法原理根据病原菌的形态特征、培养性状、在寄主上的危害症状和PCR特异性扩增片段特征作为小麦叶疫病菌的鉴定依据。5仪器和用具5.1仪器生物显微镜、超净工作台、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、光照培养箱、电子天平（1/1000g）、恒温水浴锅、高压灭菌器、冰箱。5.2用具手持放大镜、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、样品筛［1.7mm（10目）、修枝剪、接种针、载玻片、盖玻片、封口膜、菌种保藏管、离心管（1.5mL）、可调微量加样器（2.5μL～200μL）。6试剂和培养基6.1试剂葡萄糖、琼脂粉、次氯酸钠、盐酸、氯化镁、SDS、EDTA、Tris、CTAB、EDTA、无水乙醇、三氯甲烷1 SN/丙醇、异戊醇、苯酚、溴化乙锭、蛋白酶K、Taq聚合酶、dNTP、DNA分子量Marker(100bp）。6.2培养基按照SN/T1538.1制备马铃薯胡萝下培养基（PCA)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），其配方参见附录C。7检验方法7.1取样和制样按照行业标准SN/T1809的方法抽取进境小麦原粮或种子样品。选取小麦原粮或种子中具有干瘾、皱缩、霉变或变色等非正常的样品。取田间具有疑似症状的小麦病叶，在病健交界处剪取组织材料，剪成长5mm～10mm的小块备用。7.2分离培养无菌操作下将供试样品分别用3%次氯酸钠表面消毒5min～10min，灭菌水冲洗3次，移至含链霉素的PCA培养基平Ⅲ中，25℃、10h光照/14h黑暗条件下培养，3d后观察。将生长出的可疑菌落分别转到PCA平血上，26℃纯化培养5d后，观察菌落的特征，制片镜检观察，记录分生孢子梗和分生孢子的形状、大小等。将所分离的菌种纯化后转接在PDA平血培养基上，待菌落长满后，无菌操作下，用解部刀将菌落切成若干个边长约1cm左右的小方块，分别放在盛有无菌水的菌种保藏管中，用封口膜封好，室温保存。7.3常规PCR法检测7.3.1DNA提取将分离出的可疑菌落，接种到PCA培养基上，25℃培养7d。挑取生长的菌丝，用市售通用DNA提取试剂盒，提取病原菌基因组DNA。7.3.2常规PCR扩增及序列测定将供试材料用常规PCR法进行扩增，用小麦叶疫病菌的特异性引物对，该对引I物的序列为：LJY1：GTCTTTTGTCTCCAGTTCGC;LJY2:GCTGTTTGACTCTCTTTCCA。PCR反应体系总体积25μL，包含：10×Buffer2.5μL，10mmol/LdNTP1.0μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，DNA模板1μL。PCR反应程序：9℃、5min预变性；95℃、30s57.6℃、45s，72℃、45s，共35个循环；72℃延伸10min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳，凝胶成像仪观察照相，如出现目标片段大小为520bp的目标片段，同时阴性对照和空白对照没有出现目标片段，则将扩增产物进行序列测定，