SN_T 3304-2012马巴贝斯虫病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3304—2012马巴贝斯虫病检疫技术规范Quarantine protocol for Babesiosis equine2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标電准马巴贝斯虫病检疫技术规范SN/T 3304-2012*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 www.spc. net. cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16　印张 １字数 26 千字2013年6月第一版反2013年6月第一次印刷印数 1—1600*书号：155066·2-25375 SN/T 3304—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准与国际动物卫生组织（OIE)《诊断试验和疫苗标准手册》（2010)中第2.5.8章一致性程度为非等效。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：鱼海琼、王玉玲、朱来华、罗长保、赵吟、许如苏、林志雄、陈茹、田纯见。1 SN/T 3304-—2012马巴贝斯虫病检疫技术规范1范围本标准规定了马巴贝斯虫病的病原学检查、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、微量补体结合试验和聚合酶链式反应方法的技术要求。本标准适用于马巴贝斯虫病的血清学调查、诊断和监测。2 ：规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SN/T 1526　马巴贝斯虫病检测方法微量补体结合试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。B.equi.：马巴贝斯虫EDTA:乙二胺四乙酸FITC:异硫氰酸荧光素4临床诊断参照附录 A 的 A.1做出初步诊断。5 实验室诊断5.1血涂片镜检5.1.1 试剂EDTA溶液(1 mg/mL)(参见附录 A)。　10%的姬姆萨染液（参见附录A）。甲醇（分析纯）。5.1.2器械5. 1.2. 1光学显微镜。5. 1.2.2测微计。1 SN/T 3304---20125.1.3样品的采集用针头刺破耳静脉采血，滴于载玻片一端。也可采用血球富集法收取红细胞，取一离心管，加人抗凝血 6 mL～7mL，充分混合，以2000 r/min的速度离心5min，用吸管吸取上层液体弃掉,注意不要吸掉红细胞层，沉淀即为红细胞，滴于载玻片一端，以备推片。5.1.4血涂片制备将上述样品以常规方法推成血片，干燥后，将少量甲醇滴于血膜上。待甲醇自然干燥后即达固定，然后用10%吉姆萨氏染液染色20 min～30min，用水冲净染液，风干，油镜检查，依其形态特征确诊。5. 1.5 结果判定马巴贝斯虫镜检为小型虫体，，虫体多位于红细胞内，裂殖字相对较小，长度小于2～3双m，星圆形或阿米巴样，通常 4个裂殖子在一起形成四联体或“马尔他十字排列。图片参见A.2。5.2间接免疫荧光抗体试验5.2.1仪器和设备5.2. 1. 1磁力搅拌器。2荧光显微镜。5.2. 1.3微量移液器。5.2.2试剂和材料5. 2. 2. 1Pucks Saline G 溶液(pH7.2)配制方法参见附录B。山羊血清。丙酮。5.2.2. 4阴、阳性对照血清。(0.01 mol/L pH7.4 FBS,配制方法参见附录 B。FITC荧光素标记的抗马IgG。5.2.3操作步骤5.2.3. 1抗原片制作.1无菌采集感染马巴贝斯虫病动物全血，冷藏方法送至实验室。.2将装有全血的试管置台式离心机内4℃,2000r/min离心15min，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。.3向试管中加人Pucks Saline G溶液，用移液器轻柔地吹打沉积的红细胞层，重新悬浮红细胞后，4℃，2000r/min离心15min，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层，依此法重复两次，获得清洗后的红细胞。.4用吸管量得红细胞体积，然后加人其两倍体积的含有10%山羊血清的Pucks Saline G溶液，重新悬浮红细胞。即如果沉积的血球量为5ml.，则应加人含有10%山羊血清的Pucks SalineG溶10 mI..5取8μL的红细胞悬浮液滴在载玻片的一端。再拿另一载玻片，倾斜45°,常规推片，空气晾干,即得抗原片。.6依此法制备若干抗原片，将若干封好的载玻片用锡箔纸包好，注意不要磨损抗原面，置2 SN