SN_T 2754.7-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第7部分：空肠弯曲菌.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2754.7---2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP)检测方法第7部分：空肠弯曲菌Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogensin export food--Part 7 :Campylobacter jejuni2011-07-01实施2011-02-25 发布中华人民共和国发布1国家质量监督检验检疫总局码防伪 SN/T 2754.7-2011前言SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为15个部分：第1部分：金黄色葡萄球菌;第2部分：大肠杆菌0157；第3部分：志贺氏菌；-第4部分：单核细胞增生李斯特菌；第5部分：副溶血性弧菌；第6部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；第7部分：空肠弯曲菌;第8部分：肺炎克雷伯氏菌；第9部分：溶血性链球菌；第10部分：产气荚膜梭菌；第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；第12部分：溶藻弧菌；第13部分：创伤弧菌；第14部分：假结核耶尔森氏菌；第15部分：阪崎肠杆菌。本部分为SN/T2754的第7部分。本部分按照GB/T1.1一2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。本部分主要起草人：徐帮兴、肖进文、薛峰、李志勇、陈洵、曹以诚、谭志、郑文杰、张体银、王志强、李晓虹、易敏英、凌莉、曹际娟、江志毅、李苏龙、程洁、刘志强、高东微。 SN/T 2754.7--2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第 7部分：空肠弯曲菌1范围SN/T2754 的本部分规定了检测出口食品中空肠弯曲菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。本部分适用于出口食品中空肠弯曲菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.9食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测空肠弯曲菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。4防污染措施防止污染措施应符合GB/T27403.的规定。5缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine:甜菜碱Bst 酶[Bst DNA polymerase (large fragment)]:Bst DNA 聚合酶(大片段)cco N:空肠弯曲菌细胞色素 C氧化酶 I亚单位基因DNA(deoxyribonucleic acid):脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid):乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediated isothermal amplification):环介导恒温扩增Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚 SN/T 2754.7—20116技术概要根据空肠弯曲菌特有的靶序列 cco N基因(参见附录 A)设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用 Bst 酶启动循环链置换反应，在 cco N基因序列启动互补链合成,在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环 DNA混合物；从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色 变化观察判定结果。7 试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：根据空肠弯曲菌特有的靶序列 cco N基因设计一套特异性引物，包括外引物 1（F3）,外引物2(B3)，内引物1FIP)，内引物2(BIP)。外引物扩增片段长度：216bp。F3(5′-3′):GAAGCGCTTTTTGGTTCTTB3(5-3):GGTATTACTCAAGGTATGATGTGFIP(5-3):GGTGGATT