NY 573-2002弓形虫病诊断技术.pdf

ICS _11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 573 -2002弓形虫病诊断技术Diagnostic techniques for toxoplasmosis2002-08-27 发布2002-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 573—2002言前弓形虫病是由刚第弓形虫(toxoplasma gondi)引起的一种人畜共患寄生虫病。该病呈世界性分布，各种家畜，包括猪、牛、羊、犬、猫和实验动物，包括小白鼠、天竺鼠、家兔等，以及人类，都能感染弓形虫。弓形虫病可使孕畜流产死胎，急性弓形虫病可造成家畜的死亡。弓形虫感染孕妇后可引起流产，胎儿畸形或产出弱智儿。弓形虫感染成人后，可侵害神经系统、呼吸系统、心脏、淋巴内皮系统等多种器官或系统，并造成损伤，严重时会造成死亡。因此，弓形虫病具有重要的公共卫生意义。本标推由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标起草单位：中国农业大学、中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：汪明、杜重波、潘保良、刘群。 NY/T 573--2002弓形虫病诊断技术１ 范围本标准规定了弓形虫病的诊断技术要求。本标准所规定弓形虫的分离鉴定适用于本病的确诊；间接血凝试验适用于大批量样品的普查。2弓形虫的分离鉴定2.1材料准备2.1.1器材：玻璃组织研钵，无菌砂子,5mL注射器及针头。2.7.20.8%生理盐水：加人青霉素和链霉素，使其终浓度分别为100IU/mI.和10 μg/mL。2.1.3 蛋白酶。2.1.4健康实验小白鼠27只。2.2待检样品的采集及处理无菌采取病畜的脑组织、心、肝、肺、肾、骨骼肌各2g，以及3mL腹腔液，所取组织或器官材料分别放人玻璃组织研钵中，加入无菌砂子和0.8%的无菌盐水进行研磨，研磨成组织糜。研磨好的组织（器官），用0.8%的盐水配制成10%～20%的组织悬浮液。肺组织和肌肉组织悬浮液加入蛋白酶消化。消化后的组织悬浮液用于接种，腹腔液不用处理可直接接种。2.3操作方法接种：选取27只健康试验用小白鼠，分为9组，每组3只，作如下处理：空白对照组（1组）：不作任何处理；生理盐水接种组（1组）：每只小鼠腹腔接种生理盐水1mL；病料接种组（共7组）：每只小鼠分别腹腔接种2.2所制备的待检样品1mL。2. 4 检查与判定小鼠接种待检样品后，如在2d～14d内发生死亡，则应抽取腹腔渗出液涂片镜检。同时另采集脑、肝、肺、脾涂片，涂片进行姬姆萨染色后用显微镜镜检。若小鼠未发生死亡，则应在接种后的6～8周对小鼠进行捕杀，并按上述方法取样镜检。若在小鼠腹腔液中查出速殖子1或所取的组织样品中查出包囊²或缓殖子3)，则可将待检样品判为阳性。没有查出则判为阴性。当空白对照组和生理盐水接种组没有查出弓形虫时,可进行结果判定，否则应重检。当所检样品中，有一个为阳性，即说明被检动物已被弓形虫感染，将其判为阳性；当所检样品全部为阴性时，将被检动物判为阴性。1）速殖子呈月芽形,长为 4 μm～8 μm,宽为2 μm～4 μm。包囊呈球形,囊壁薄,直径为 25 μm～100 μm2）包囊内往往充满圆形或月芽状的缓殖子,缓殖子长为 3 μm,宽为 2 μm～3 μm。3）缓殖子对姬姆萨染液高度敏感，呈嗜碱性。1 NY/T 573—20023间接血凝试验(IHA试验)3.1材料准备3.1.196(12×8)孔110V形有机玻璃反应板，100μL微量加样器,振荡器，医用离心机，移液管等。3.1.2弓形虫诊断制剂(IHA抗原）,稀释液，阳性、阴性血清。3.2操作方法3.2.1弓形虫诊断制剂按瓶上标示毫升数加人灭菌蒸馏水稀释摇匀，1500r/min～2000r/min离心5min～10 min，弃上清液，加等量稀释液摇匀，置4℃下静置24h后使用。3.2.2采被检疫动物或人的血液2mL～2.5mL,分离血清（应无血球)。3.2.3用微量加样器往96孔有机玻璃反应板每孔加75μL稀释液。每个样品加4孔。每块板设阳性、阴性血清对照。对照均加8孔。3.2.4往各组第1孔加25 μL的被检血清，或阳性血清,或阴性血清。3.2.5用加样器对每组进行1：4系列稀释，被检血清组稀释至第3孔，阳、阴性对照组稀释至第7孔。被检血清组第 4孔，阳、阴性对照组第8孔为稀释液（见表1)。表1各组各孔的稀释度孔(另一组)(第一组)641616被检血清组64稀释液对照40244 09616 384稀释液对照阴性对照组416642561 0244 09616 384阳性对照组稀释液对照43.2.6将准备好的诊断液摇勾,用移液管加 25 μL诊断液于每孔中。加完后将反应板置微型振荡器上振荡 1 min～2 min,直至诊断液中的血球分布均勾，从振荡器