SN_T 3728-2013进出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法 量子点免疫荧光法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3728—2013出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法量子点免疫荧光法Rapid determination of Campylobacter jejuni in food for export-Quantum dots immuno-fluorescence method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国D发布ww.CnW315国家质量监督检验检疫总局刮涂属查真伪 SN/T 3728—2013前言本标准是按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、合肥工业大学。本标主要起草人：薛峰、张睿、蒋原、曾德新、陈雷、陈颖、栾军、张鹏飞、陈伟。I SN/T 3728—2013出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法量子点免疫荧光法1范围本标准规定了出口食品中空肠弯曲菌的量子点免疫荧光检测方法。本标准适用于出口食品中空肠弯曲菌的快速检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.9食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GB19489　实验室　生物安全通用要求3生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测空肠弯曲菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。4技术概要本标准采用量子点免疫荧光分析技术检测空肠弯曲菌，主要包含以下步骤：a）增菌，按照GB/T4789.方法进行样品制备和增菌。b）以免疫磁珠为载体，将菌液中的空肠弯曲菌快速富集在磁珠表面。将荧光量子点标记的空肠弯曲菌抗体与免疫磁珠富集的空肠弯曲菌溶液相互作用，利用荧光c）显微镜检测磁珠复合物表面的荧光，结果判定。5试剂和材料5.1表面带羧基的水溶性量子点（浓度：5 μmol/L）。5.2空肠弯曲菌单克隆抗体包被的免疫磁珠（浓度约106个磁珠/mL）。5.3空肠弯曲菌多克隆抗体（浓度约1 mg/mL）5.41-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)5.5N-羟基琥珀酸亚胺（Sulfo-NHS）。5.6超滤离心管（截留相对分子质量：10kDa）。5.7透析袋（截流相对分子质量：14kDa，直径1cm）。5.8单氨基聚乙二醇(PEG-NH²，相对分子质量:5 kDa）。 SN/T 3728—20135.9载玻片。5.10盖玻片。5.11空肠弯曲菌株参考菌株:Campylobacter,ATCC110902、ATCC110903、ATCC110904、ATCC110905。5.12 PBS缓冲液:参见附录 A 中 A.1。5.13 PBST洗涤液:参见 A.2。5.14MES缓冲液:参见 A.3。6仪器和设备6.1次性手套。6.2移液器:量程 0.5 μL～10 μL，精度 0.01μL;量程 10 μl～100 μl，精度 0.1 uL;量程 100 μ～1 000 μL,精度 1μL。6.3灭菌移液器吸头。6.41.5 mL塑料离心管。6.51.5 m离心管架。6.6 1.5 mL磁架。6.7丙高速台式离心机，转速不低于20000 r/min,最大相对离心力不低于10000×g。6.83恒温摇床，温度偏差不超过士1℃。6.9涡旋混合器。6.10旋转混合器。6.11高压灭菌锅。6.12计时器。6.13荧光显微镜，配置有汞灯光源和600nm士20nm附近窄带滤光片。7检测程序食品中空肠弯曲菌量子点免疫荧光检测程序见图1。2 SN/T 3728—2013待测样品选择性增菌液或待测菌株羧基量子点活化免疫磁珠富集空肠弯曲菌，抗体共价偶联在量子点表面然后用无菌缓冲液洗涤磁珠重悬在缓冲液中离心分离纯化量子点抗体复合物t富集空肠弯曲菌的磁珠与免疫子点混合进行免疫识别反应磁性分离磁珠复含物，荧光显微镜下观察结果1阴性阳性传统方法确认报告图 1 食品中空肠弯曲菌量子点免疫荧光检测程序8操作步骤8.1样品制备、增菌培养按照GB/T4789.9方法进行样品制备和增菌。8.21免疫磁珠富集8.2.1免疫磁珠富集条件免疫磁珠富集应该在增菌6 h后进行，必要时也可以继续培养12h～18h后再分离次。8.2.2磁珠富集病菌的操作步骤操作过程要无菌环境下进行，避免任何外部的污染和产生气溶胶。对于8.1获得的增菌液：直接取该增菌液 1mL加到1.5 mI 无菌离心管中。a）b）分别取20μL单抗包被的免疫磁珠，1mL增菌液上清，在1.5mL无菌离心管中混合。c)在旋转混合器上混合上述混合液，室温下，以 12 r/min～20 r/min 的速度混合 30