SN 1173-2003鸡病毒性关节炎抗体检测方法 酶联免疫吸附试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1173-2003鸡病毒性关节炎抗体检测方法酶联免疫吸附试验Protocol of detection antibodies against avian viral arthritis virus--Enzyme-linked immunosobert assay(ELISA )2003-03-17发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1173—2003前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标主要起草人：钟安清、杨建中、卢体康。本标准系首次发布的检验检疫行业标推。I SN/T 1173-2003鸡病毒性关节炎抗体检测方法酶联免疫吸附试验1范围本标准规定了应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鸡血清中抗鸡病毒性关节炎抗体的方法。本标准适用于抗鸡病毒性关节炎的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。2操作方法2.1原理本标准采用 ELISA间接法。该方法利用抗原抗体反应具有特异性,将特异性的鸡病毒性关节炎ELISA抗原吸附到固相载体的表面后,待测物中若含有相应的抗鸡病毒性关节炎病毒的抗体,则可与所包被的抗原相结合，并能继续和相应的羊抗鸡的酶标抗体结合形成复合物。在遇到相应的底物时，复合物中的酶能催化底物反应。其显色的深浅与相应的抗体量成正比。可借助颜色反应的深浅来定性。在建立标准曲线的情况下还可以定量(本标准仅作定性用)。2.2试剂和材料2.2.1试剂配方见附录A。a)包被液：0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6)。b）洗涤液：含0.5mol/L氯化钠及0.1%Tween-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2~7.4).c)封闭液：含5%特牛血清及0.1%Tween-20的TNE溶液。d)底物溶液：含0.04%邻苯二胺(OPD)、0.05%双氧水的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH5.0)。e）终止液:2 mol/ I. 硫酸溶液。f)鸡病毒性关节炎 ELISA抗原、羊抗鸡 IgG酶标抗体、阳性参考血清和阴性参考血清:均由权威机构或国家认可的生产商提供。2.2.2设备聚苯乙烯微量反应板（40孔或96孔）、酶标检测仪、微量移液器、塑料滴头、50μL或100μL微量注射器。2.3操作方法2.3.1 包被将鸡病毒性关节炎ELISA抗原用包被液稀释到工作浓度，每孔加100uL，置37℃水浴1h后再置4℃过夜后备用。2.3.2 洗涤甩干包被液，每孔加封闭液200μL，置37℃水浴90min，甩干后用洗涤液洗涤三次，甩干。2.3.3吸附将待检血清用封闭液作100倍稀释，每孔加100μL，每份血清作两孔，置37℃水浴1h，甩干后用洗涤液洗涤五次，甩于。每板的最后一排加阳性参考血清和阴性参考血清。1 SN/T 1173--20032.3.4加酶标二抗将羊抗鸡酶标抗体用封闭液稀释到工作浓度，每孔加100μL，置37℃水浴1h，甩干后用洗涤液洗涤五次，甩干。2.3.5.加底物每孔加新配制的底物溶液100 μL,避光 37℃反应5min。2.3.6加终止液每孔加人 2 mol/L硫酸溶液 50 μL,终止反应。2.3.7测定 OD 值硫酸用酶标仪在波长 490 nm处测定各孔的OD值，必须在加入终止液后10min内完成。2.4结果判定当标准阳性血清与标准阴性血清的 OD值的比值大于 2时，方可进行结果判定。待检样品的 P/N比值按式(1)计算。2. 4. 1 计算 P/N 比值待检血清孔 OD 值(1)P/N -标准阴性血清OD平均值2.4.2判定P/N比值大于等于2为阳性；小于1.5为阴性;之间为可疑，应重检后大于1.5为阳性。2 SN/T 1173—2003附录A(规范性附录)试剂配方A.1 0. 1 mol/L 碳酸盐缓冲液(pI9.6)碳酸氢钠(NaHCO3 - 10H,O)11.45 g碳酸氢钠(NaHCO:)5.04 g加蒸馏水或去离子水至1000 mL，充分溶解即成。A. 2 0. 01 mol/L 磷酸盐磷酸氢二钠缓冲液(PBS,pH7. 2~7. 4)甲液:磷酸氢二钠(NazHPO,·12H,O)71.70 g蒸馏水加至1000ml,充分溶解。乙液:磷酸二氢钾(KH2PO.·H2O)31.20 g蒸馏水加至1000mL，充分溶解。使用液：取甲液81mL，乙液19mL，氮化钠0.17g，加蒸馏水至2000mL，充分溶解即得。A.33TNE溶液氯化钠0. 9%Tris0. 05 mol/LEDTA0. 001 mol/LA.4含0.04%邻苯二胺(OPD)、0.05%双氧水的柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.0)邻苯二胺40 mg30%过氧化氢0