SN_T 3328-2012扇贝物种鉴定方法 SSR方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3328—2012SSR 法扇贝物种鉴定方法Protocol of identification of scallops---Simple-sequence repeats(SSR)2012~12-12 发布2013-07-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3328—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：方绍庆、岳志芹、尹伟力、刘宁、张京宣、于红光、王颖、许红岩、钟响、鲁闽、段效辉、栾晶、粟智平、耿金培。 SN/T 3328—2012扇贝物种鉴定方法SSR 法1范围本标准规定了扇贝物种SSR鉴定方法。本标准适用于进出境冰鲜、干制、熟制罐头类水产品中对扇贝的种类鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1简单序列重复simple sequence repeat;SSR微卫星microsatellite侧翼区序列比较保守，核心区以1～6的核苷酸序列成首尾相连的串联重复。微卫星在真核生物基因组中分布广泛，具有多态性丰富、共显性遗传、结果稳定等优点，目前已在种群遗传分析、亲本鉴定、遗传连锁图谱构建等方面得到广泛应用。3.2聚合酶链式反应polymernase chain reaction;PCR以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的 DNA片段）通过高温（DNA分子变性)和低温（引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸）交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。4原理制备并筛选栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝小的DNA片段，利用小插人片段文库筛选微卫星标记，构建小型基因组 DNA文库。然后使用含有特定重复序列的寡聚核苷酸序列的序列设计引物,对四种扇贝进行特异性PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目的物种扩增出DNA片断判定扇贝种类。扇贝形态特征参见附录 A。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备PCR仪、组织研磨器、超净工作台、制冰机、高速冷冻离心机、水浴锅、台式小型离心机、常规冰箱、1 SN/T 3328--2012旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统。5.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。5.2.1水：应符合 GB/T 6682中一级水的规格。用于 PCR(包括核酸提取)时所用的水均用DEPC处理以除掉 RNA 酶。5.2.2 苯酚。5.2.3三氯甲烷。5.2.4蛋白酶 K。5.2.5异丙醇。5.2.6无水乙醇。5.2.775%乙醇。5.2.8硫酸镁。5.2.9dNTP.5.2.10Taq DNA 聚合酶。5.2.11PCR缓冲液。5.2. 12DNA Marker 2003核酸染料。5.2.14琼脂糖。5.2. 15电泳缓冲液（配方见附录B）。5.2.16上样缓冲液(配方见附录B)5.2.17引物见表1。表1／引物序列种类引物序列（5-3)-F1F : AGTAGCCCCACAGGAACCC栉孔扇贝F1R: TCCAGCACTCAGCAAGACCZhikong scallopF2F:CAGACTGTQGGTACTTGTC(Chlamys farreri)F2R : AAAGTCTGTACCTCTCTGN1F: TTAGATAGCACTTGGGACAC华贵栉孔扇贝N1R:GTCACTGAGGAAGAGGAAAGNoble scallop N2F : ATCTGTCAGGTTCACTGATTG(Chlam ys nobilis )N2R: TTACCACTCTCTTAGAATCCGY1F:CCAACAACCAAGAGGGAACG虾夷扇贝Y1R: AATCGCGGCAAGCATAACTGYesso scallopY2F : TTATACATACCAGCGTAGC(Mizuhopecten yessoensis )Y2R : TTAGGTGCCTGTTATCTTC11F: TGTCAGAGTTCACAGCTAGGTGACC海湾扇贝11R:GGTTTCTCCTTGTTGTGGTCTGGBay scallop12F: ACTTCTCAACGATGTGTAAGAG(Argopecten irradians)12R :GTG