SN 1395.3-2005禽衣原体病间接补体结合试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1395.3—2005禽衣原体病间接补体结合试验操作规程Protocol of indirect complement fixation test for avian chlamydiosis2005-02-17发布2005-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1395.3—2005前言本标准的附录 A和附录 B为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：颜思通、林志雄、朱道中、郭光楷、刘尚文。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 1395.3—2005禽衣原体病间接补体结合试验操作规程1范围本标准规定了禽衣原体病间接补体结合试验的操作方法。本标准适用于禽类(鹦鹉、鸽子除外，但包括老龄鸽)衣原体病的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理补体具有能与特异性抗原抗体复合物相结合并发挥作用的特性，可用来间接测定某些抗体的存在。在补体结合反应中，将已知抗原、补体和被检血清先行混合，经过相当时间作用后，再加入被溶血素致敏了的红细胞。从红细胞是否被溶解，间接测定被检血清中有无特异性抗体的存在，这是直接补体结合试验。但部分血清抗体与抗原形成的复合物不能结合补体，需再加人抗该抗原的抗体，后者形成复合物后才能结合补体，与溶血系统起反应，这是间接补体结合试验。由于部分禽类血清中的衣原体抗体与特异性抗原形成的复合物不能结合补体，所以必须借助指示血清进行间接补体结合试验。4器材和试剂4.1器材4.1.1电热恒温水浴箱。4.1.2高速离心机。4.1.3冰箱。4.1.4振荡器。4.1.512 mm×37 mm 小试管、刻度吸管、试管架。4.1.6微量可调移液器、96孔U型微量反应板。4.2 试剂4.2.1蒸馏水试验用蒸馏水符合GB/T6682中三级水的规定。4.2.2冻干补体、溶血素、衣原体补反抗原按说明书使用。4.2.3标准阴性血清、阳性血清和指示血清标准阴性血清，按说明书使用。间接补体结合试验标准阳性血清是鸭或猪的免疫血清。1 SN/T 1395.3-2005指示血清为直接补反试验的标准阳性对照血清。4.2.4被检血清按常规方法无菌采集被检禽血液，分离血清。被检血清应无溶血，无污染，试验前置56℃水浴灭活30min。4.2.52%公绵羊红细胞悬液无菌采集成年健康公绵羊颈静脉血液，迅速加人到等体积红细胞保存液（Alsever氏液，配制见附录A)内，4℃保存。试验前用生理盐水洗涤三次，以完全去除血液中红细胞以外的物质为准。最后次洗涤,3000 r/min离心10 min，沉淀的血球泥用生理盐水配成 2%红细胞悬液（体积分数)。5预备试验5.1溶血素效价测定5.1.1效价测定法先将溶血素作1：100稀释，然后按表1系列稀释后，再按表2操作。表1 溶血素稀释法单位为毫升5管号1234781: 10001 : 20001 : 3000稀释倍数1 : 40001: 50001 : 60001: 70001:80001溶血素100×?-一~溶血素 1000×111111+-生理盐 2溶血素效价测定法单位为毫升管号12345o78对照稀释倍数1 : 10001 : 20001:3000|1: 4000|1: 5000|1:6000|1:70001: 80001:100补体红细胞0. 10. 1稀释溶血素0.10. 10. 10. 10. 10.10.10. 20. 20. 2生理盐水0. 20. 20. 0. 30. 5 0. 2补体(1:40)0.20. 20. 20. 20. 2 0. 2 0. 2 一0. 2 2%红细胞0. 10. 10. 10. 0.11充分摇匀，37℃水浴30min结果判定+++++ +++++++++++++++++5.1.2效价判定能使2%绵羊红细胞完全溶血的最大溶血素稀释倍数为该溶血素效价或1个溶血素单位。表2所示，溶血素效价为1：4000（第4管）。溶血程度应对照标准溶血管判断,标准溶血管的配制见附录 B。溶血程度可用符号表示：为完全溶血;-+为75%溶血;+＋ 为50%溶血;++＋ 为25%溶血;十十十十（#)为完全不溶血。2 SN/T 1395.3-20055.2致敏红细胞2%公绵羊红细胞悬液加含2单位溶血素的等量生理盐水，混合均匀后