NY_T 2478-2013苹果品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 67.080B 31NY中华人民共和国农业行业标准NY/T果品种鉴定技术规程SSR分子标记法Identification of apple variety--SSR marker method2014-04-01实施2013-12-13 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2478--2013目次前言?范围12规范性引用文件术语和定义3+4原理·5 仪器设备及试剂++++6溶液配制7引物...8参照品种及其使用·9操作程序10等位变异数据采集11判定方法….仪器设备及试剂附录A（规范性附录）附录B(规范性附录)溶液配制·附录C(规范性附录)核心引物·附录 D(资料性附录)参照品种名单+t NY/T 2478—2013前 言本标准按照（GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归II。本标准起草单位：西北农林科技大学、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：高华、李硕碧、王立新、杨江龙、赵政阳、陈企村、杜联盟、张丽。I NY/T 2478—2013苹果品种鉴定技术规程SSR分子标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记进行苹果（MalusdomesticuBorkh.）品种鉴定的试验方法、数据采集及判定方法。本标准适用于基于SSR分子标记的苹果品种DNA分子数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则GB/T19557.4植物新品种特异性、-致性和稳定性测试指南苹果3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1核心引物coreprimer指人工合成的，多态性、稳定性、重复性等综合特性较好，作为统一用于品种DNA指纹鉴定必须选用的一套 SSR 引物。3. 2参照品种reference variety参照品种是指多样性好，核心引物位点扩增片段大小已知的一组品种。参照品种用于比对待测样品在某个SSR位点上等位变异扩增片段的大小，校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差。4原理SSR广泛分布于苹果基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。针对两侧序列高度保守的特点，设计-对特异引物，利用PCR(聚合酶链反应Polymerasechainreaction)技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段，在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定苹果品种。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制溶液配制方法见附录B。7引物引物相关信息见附录C。 NY/T 2478--20138参照品种及其使用参照品种的名单及代码参见附录D。在进行等位变异检测时.应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。注1：同··名称不同来源的参照品种的某一位点.上的等位变异可能不相间.在使用其他来源的参照品种时，应与原参照品种核对.确认无误后使用注2：对于附录D中未包括的等位变异.应按本标准方法.确定其大小和对应参照品种。9操作程序9.1样品准备每份样品检测3个单株，进行混合分析。9.2DNA提取a）称取苹果幼嫩叶片0.25g，放入一20℃预冷的研钵中，加人液氮迅速研磨多次，至粉末状后，立即装入2mL离心管中.依次加人1.5mL预热（70℃）的2%（TAB提取缓冲液、150μul.经预热（70℃）的CTAB/NaCI溶液、45uLβ-巯基乙醇（V：V)，充分摇匀；b)65℃恒温水浴1h，期间每隔10min摇动1次。于4℃12000g离心15min；c)1取上清液，加人等体积的氯仿一异戊醇（24：1.V：V)，轻轻颠倒混匀，静置10min，12000g，4℃离心15min;d）上清液转人另1个2ml.离心管中，加人2倍体积一20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀，在一20℃下静置30min12000g，4℃离心15min，奔上清液；e)沉淀的IDNA用70%乙醇洗涤2次.再用500μL无水乙醇浸泡清洗1次；弃乙醇，离心管置于超净工作台风干，溶于200μul.双蒸水中，加10g/L的Rnase1μL，37℃温浴30minf)再加人等体积的氯仿-异戊醇（24：1，V：V），轻轻混匀，12000g常温离心15min；取上清液，加入2倍体积一20℃预冷的无水乙