SNT 2390-2009国境口岸白蛉携带利什曼原虫检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2390--2009国境口岸自携带利什曼原虫检测方法Detecting of Leishmania sp. in sandfly at frontier port2009-09-02发布2010-03-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局者余显线 181015*,查数码防伪 SN/T 2390—2009前言本标准的附录 A、附录 B、附录 C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提取并归口。本标准由中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：孙立新、丁永健、陈瑞、姚峰、宋锋林。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 SN/T 2390—2009国境口岸白携带利什曼原虫检测方法1范围本标准规定了国境口岸白携带利什曼原虫的检测对象、生物安全要求、样品采集与处理、检测程序和结果报告。本标准适用于国境口岸白龄携带利什曼原虫的实验室检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本适用于本标准。GB19489实验室‧生物安全通用要求3 术语下列术语和定义适用于本标3. 1白sandfly属双翅目毛科白亚科，是一类体小多毛的吸血昆虫,可传播利什曼原虫病。全世界已发现 600重要种类有中华白和中华百长管亚种。余种，我国已知有3属31种（亚种)，3. 2利什曼原虫 Leishmania sp.属于动基体目，锥虫亚目，锥虫科，利什曼属。是利什曼原虫病的病原体。生活史有前鞭毛体和无鞭毛体两个时期，前鞭毛体寄生于白的消化道内，无鞭毛体寄生于尽、犬科动物及其他脊椎动物的单核-巨噬细胞内。3.3前鞭毛体promastigote成熟的虫体呈梭形或长梭形，有根伸出体外的鞭毛，为要体运动器官。虫体大小为（14.3μm~20 μm) X(1. 5 μm~1. 8 μm)4 检测对象国境口岸白。5生物安全要求5.1采集白时应做好个人防护,防止被白叮咬。5.2样品处理应在无菌条件下进行。5.3实验室结构和设施、个人防护、操作应符合 GB19489的要求。6　标本的采集和保存6.1采集方法标本采集采用捕龄管捕集法。1 SN/T 2390—20096.2采集地点以国境口岸白龄活动代表性生境为采样地，并在口岸货场、集装箱停放地、口岸生活区、山洞口、丛林地区、沿河、沿海区选择并设置监测点。6.3样品保存将采集的白置于无菌的试管中，贴好标签，带回实验室，分类鉴定备检。7 检测程序7.1样品处理7.1.1样品预处理将白龄置于一20℃冰箱 5 min～10 min,冷冻致死。7.1.2　样品处理将处死的白置于无菌的试管内，管中加人少量无菌0.3%～0.5%的石碳酸生理盐水,轻摇试管以脱去白龄体表的毛。取出脱去体毛的白，移入另一支含有无菌生理盐水的试管内，反复洗涤两次。7.2解剖白具体操作参见附录 A。7.3分离和培养前鞭毛体7.3.1直接涂片镜检将分离的白消化道直接涂片，染液镜检。有时由于白消化道的前鞭毛体较少，直接涂片，不易发现前鞭毛体。7.3.2培养检测将白消化道组织研碎，直接接种到 NNN培养基内，培养15 d后,涂片镜检。具体培养方法参见附录 B。7.3.3动物接种将白消化道组织研碎,直接注人实验动物（小白鼠)的腹腔或皮下，1个～2个月，解剖动物,取淋巴结涂片，镜检。7.4前鞭毛体的涂片、染色与镜检具体操作参见附录 C。8结果报告镜检发现无鞭毛体，报告利什曼原虫检测阳性。镜检未发现无鞭毛体，报告利什曼原虫检测阴性2 SN/T 2390—2009附录A（资料性附录）白的解剖A.1　主要设备和材料解剖镜、解剖针、镊子、载玻片、解剖刀、无菌生理盐水。A.2操作方法A.2.1用镊子将去除体毛的白置于载玻片上，在解剖镜下用解剖针除去翅与足。A.2.2将白在无菌牛理盐水中浸泡 5 min,再置于滴有无菌生理盐水的载玻片中。A.2.3左手用解剖针轻轻按住白的中胸前方，右手用细小解部刀或有刃的针于中胸背板中部稍后的地方至后足基部的直线上将颈管切断。A.2.4安排胸的后面一段标本的位置，使腹尖朝向解剖者的右侧,左手用解剖针在第七腹节后缘上从腹的背侧边压向腹的腹侧边缘，使腹内器官压向腹侧；然后，用右手持解剖针于第七腹节于第八腹节连接处的背侧割刻一小裂口,左手相反地用针从腹的腹侧边缘压向腹的背侧边缘，使腹内器官压向背侧，然后右手随即用针于腹部第九节连接处的腹侧上割刻一小裂口。A.2.5移动标本的位置，使白的腹尖朝向解剖者的左侧，用左手的针轻轻横按于