SNT 2497.23-2010进出口危险化学品安全试验方法 第23部分：细胞器的分离实验方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2497.232010进出口危险化学品安全试验方法第23部分：细胞器的分离实验方法Test method of import and export dangerous chemicals-Part 23 : Separation of cellular organelles2010-09-16实施2010-03-02 发布中华人民共和国发布星送618515查询真5国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2497.23--2010前言SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分：第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验；第3部分：大型繁殖试验；第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；-第5部分：睾丸细胞UDS试验；第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第7部分：小鼠耳肿胀试验；第8部分：窝淋巴结试验；第 9 部分:血清溶血素测定试验;第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验；第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第15部分：PCR-SSCP实验；第16部分：Western-Blot 实验；第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；第18部分：DNA加合物的检测方法；第 19 部分:Northern Blot 实验;第20部分：Bradford法测定蛋白质含量；第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分:DNA的 Tm值测定方法;第23部分：细胞器的分离实验方法；-第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；第25部分：体液免疫功能试验；第26部分：巨噬细胞功能试验；第27部分：流式细胞术检测凋亡；第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；-第29部分：生化需氧量(BOD)测定。本部分为SN/T2497系列标准的第23部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吕刚、王利兵、冯智勐、李学洋、赵青、庞震。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2497.23—2010进出口危险化学品安全试验方法第23部分：细胞器的分离实验方法范围1SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品安全试验细胞器的分离实验方法中，试验样品、试验溶液和试验步骤。本部分适用于进出口危险化学品安全试验细胞器的分离实验法。2术语和定义下列术语和定义适用于本部分2.1线粒体mitochondrion真核细胞内的双层膜细胞器，是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所。2.2微粒体‧microsomes细胞被匀浆破碎时，内膜系统的膜结构破裂后自已重新封闭起的小囊泡（主要是内质网和高尔基体），这些小囊泡的直径大约100lnm-左右是异质性的集合体2.3 endoplasmic reticulum内质网体在细胞中由膜围成的隧道系统,是细胞中的重要细胞器。3原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同离心的沉降速度也不相同，根据这一原理，用差速离心法，,再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，先用低速使较大的颗粒沉淀，如细胞核、线粒体等得以分离。4 试剂4.1生理盐水4.2RSB溶液Tris·Cl的终浓度为10mM;MgCl²的终浓度为 3mM;KCl的终浓度为10 mM。用稀盐酸调pH值至7.4,高压灭菌后,4℃保存。4.3 2×Buffer E溶液中各组分含量为:D-山梨醇的终浓度为2M;HEPES 的终浓度为10mM;EDTA 的终浓度为2 mM。用稀 NaOH溶液调 pH 值至7.4,膜过滤除菌,4℃保存。5 试验步骤5.1细胞裂解将细胞用 RSB溶液重悬,按 1：10的体积比加人 3%的 NP-40,反复混匀，冰浴10 min。5.2细胞核与线粒体的分离在超速离心机上，将细胞裂解物以5000r/min离心20 min，收集上清液； SN/T 2497.23-2010在沉淀中加人等体积的2×Buffer E,重悬后再次以5000 r/min 低速离心20 min，收集上清液；合并两次的上清液，并以13000 r/min(12000×g)离心1h,沉淀即为细胞核(Nuclear)与线粒体（Mitochondrial）,将其重悬于RSB中，分装后一80 ℃冻存。5.3微粒体和内质网体的分离将13000 r/min离心所得的上清液再次以23000r/min(40 000×g)离心1h，所得上清液为细胞浆液,分装后一80℃冻存；收集沉淀，此时沉淀为微粒体与内质网体，小心的用5 mL1×BufferE洗涤沉淀