NY_T 1903-2010牛胚胎性别鉴定技术方法 PCR法.pdf

ICS 65.020.30B 43NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1903—2010牛胚胎性别鉴定技术方法PCR法Procedures for sex identification of bovine embryos-PCR techniques2010-09-01实施2010-07-08 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T言本标准遵照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：全国畜牧总站。本标准主要起草人：王志刚、刘丑生、于福清、赵俊金、邱小田、史建民、孟飞、韩旭。 NY/T 1903—2010牛胚胎性别鉴定技术方法　PCR 法1范围本标准规定了聚合酶链式反应(PCR)方法鉴定胚胎性别的操作方法。本标准适用于普通牛(Bos taurus)胚胎性别鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GA/T 383法庭科学 DNA 实验室检验规范SN/T1119进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求3原理从被检胚胎中取出部分细胞,提取DNA,利用Y染色体上的特异序列设计引物进行扩增和检测，根据扩增结果鉴定性别。4　取样4.1胚胎预处理冷冻胚胎在室温下停留 10 s,然后 32℃温育 20 s,用胚胎清洗液将附着在胚胎周围的细胞与碎片彻底洗除,待用;新鲜胚胎直接用胚胎清洗液将附着在胚胎周围的细胞与碎片彻底洗除,待用。4.2胚胎细胞取样4.2.1显微分割法应用显微操作仪切开透明带,取出 4个～8个胚胎细胞。4.2.2徒手分割法先用0.1%～0.2%链霉蛋白酶软化透明带,在实体显微镜下，用切割针切割胚胎,取出 4个～8个细胞胚胎细胞。5　鉴定5.1试剂和仪器设备试剂和仪器参见附录A。5.2 鉴定过程5.2. 1 DNA 提取蛋白酶K消化法将胚胎细胞移人 PCR管中,加入 200 μL～500 uL 胚胎裂解液,55℃消化 15 min～30 min,95℃～98℃灭活蛋白酶K5min～10min，10000Xg离心30 s～45s,取上清液作为PCR反应模板。加热释出法将胚胎细胞移人PCR管中,加人200μL～500μL灭菌双蒸水，100℃煮沸 10 min,10000×g离心30 s～45 s,取上清液作为为 PCR反应模板。1 NY/T 1903-—20液氮反复冻融法将胚胎细胞移人 PCR管中,加人200μL～500 μL灭菌双蒸水,用液氮反复冻融几次,10000×g 离心30 s～45 s,取上清液作为 PCR反应模板。5.2.2目的基因片段 PCR 扩增引物制备引物1序列(牛Y染色体重复序列引物)：引物 1F 5′- GAT,CAC,TAT,ACA,TAC,ACC,ACT-3;引物 1R 5-GCT,ATG,CTA,ACA,CAA,ATT,CTG-3。引物 2序列（牛特异性 DNA序列的引物）：引物 2F 5′- TGG,AAG,CAA,AGA,ACC,CCG,CT- 3;引物 2R 5- TCG,TCA,GAA,ACC,GCA,CAC,TG-3。将合成的引物瞬时离心,加人灭菌双蒸水,室温溶解30 min,分装，一20℃冷冻保存。其中,加入灭菌超纯水的体积V(μL),按式(1)计算：V = 33 ×OD × 10%(1)MW式中:MW引物分子量；OD--DNA260nm吸收的光密度。5. 2. 2. 2 PCR 反应体系PCR反应体系见表 1。表 1 PCR 反应体系使用量组分及浓度1.5 μL10 X buffer0. 9 μL~1. 5 μLMgCl2 (25 mmol/ L)0. 9 μL~1. 2 μLdNTPs(25 mmol/ L)0. 15 μL~0. 75 μL引物 1(10 pmol/ μL)0. 15 μL~0. 75 μL引物 2(10 pmol/ μL)1 μLDNA模板0. 75 U~1. 0 UTaq DNA 聚合酶(5U/μL)ddH,O加至 15μL5.2. 2.3 PCR 反应条件94℃预变性4 min,然后进行10个～15个循环的扩增反应,每个循环包括 94℃变性 20 s～30 s，52℃～58℃退火 30 s～45s,72℃聚合30 s～45 s;再进行20个～25个循环的扩增反应,每个循环包括94℃变性20 s～30 s,52℃～58℃退火30 s～45s,72℃聚合 30 s～45 s;72℃延伸10min,4℃保存。首先加入引物1，扩增10个～15个循环后再