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细菌菌落总数的测定(精) 《技能训练库》综合技能实训指导书 实训项目名称 细菌菌落总数的测定 学时 6学时 实训目的 1.掌握细菌菌落总数测定的程序 2.学会国标法测定菌落总数的方法和技能 6. 及时将 15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃ ±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 （二） 培养 1．待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃ ±1 ℃培养48 h±2 h。水产品30 ℃ ±1 ℃培养72 h±3 h。 2．如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ），凝固后翻转平板，按1 条件进行培养。 （三） 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 1．选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的 平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 2．其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 3．当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 五、 结果与报告 (一)菌落总数的计算方法 1．若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL ）样品中菌落总数结果。 2．若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算： N = ∑C/(n1 +0.1n2 )d ………………………………… （1） 式中： N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 示例： 稀释度 1:100 （第一稀释度） 1:1000 （第二稀释度） 菌落数（CFU） 232，244 33，35 N＝∑C/(n1+0.1n2)d ＝232+244+33+35/[2+(0.1×2)]×10-2＝544/0.022＝24727 上述数据修约后，表示为25000或2.5×104 。 3．若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 4．若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 5．若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1乘以最低稀释倍数计算。 6．若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300 CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 （二） 菌落总数的报告 1．菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 2．菌落数大于或等于 100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 3．若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 4．若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 5．称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。 附录A A.1 平板计数琼脂（plate count agar，PCA ）培养基 A.1.1 成分 胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL A.1.2 制法 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH7.0±0.2。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。 A.2 磷酸盐缓冲液 A.2.1 成分 磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g、蒸馏水500mL A.2.2 制法 贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.