NY 772-2004禽流感病毒RT-PCR试验方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 772—2004禽流感病毒RT-PCR试验方法2004-02-17发布2004-02-17 实施中华人民共和国农业部发布 中华人民共和国农业行业标准禽流感病毒 RT - PCR 试验方法. --NY/T 7722004***中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼）（邮政编码：100026网址： )中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销***印张 1开本 880mm×1230mm 1/16字数14千字2004年2月北京第1次印刷2004年2月第1版印数：1～3000册书号：16109－318侵权必究版权专有举报电话：（010NY/T 772—2004前 言本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准推荐了两种试验方法。本标准中附录 A、附录 C为规范性附录，附录 B、附录 D为资料性附录。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：王秀荣、孙明、刘明、王宏伟、陈化兰、刘丽玲。 NY/T 772—2004禽流感病毒 RT一PCR试验方法(一)1范围本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒 H5、H7、H9 血凝素亚型及 N1、N2 神经氨酸酶亚型的 RT-PCR 鉴别技术。本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款,凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术3实验室条件3.1仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外凝胶成像仪、微量移液器、水浴箱等。3.2 从事 RT-PCR工作的实验室尽可能分区,根据条件划分出 RNA提取区、基因扩增区、电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。3.3注意个人防护和环境保护,电泳中用到的EB可诱发基因突变,试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过焚烧进行无害化处理。4试剂的准备4.1 试剂4.1.1变性液见A.1。4.1.22M 醋酸钠溶液(pH4.0)见A.2。4.1.3水饱和酚(pH4.0)。4.1.4氯仿/异戊醇混合液见A.3。4.1.5 M-MLV 反转录酶(200 u/μL)。4.1.6 RNA 酶抑制剂(40 u/uL)。4.1.7 Taq DNA 聚合酶(5 u/μL)。% 琼脂糖凝胶见 A.4。4.1.950×TAE缓冲液见A.5。4.1.10 溴化乙锭(10 μg/μL)见A.6。4.1.11加样缓冲液见A.7。4.1.12焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水见A.8。4.1.135×反转录反应缓冲液见A.9。4.1.14 2.5 mmol dNTPs 见 A.10。4.1.15 10 ×PCR Buffer 见 A.11.1 NY/T 772—20044.1.16DNA分子量标准。4.2引物见附录 B。5 操作程序5.1样品的采集和处理按照GB/T18936中提供的方法进行。5.2RNA 的提取5.2.1设立阳性样品对照、阴性样品对照。5.2.2 异硫氰酸胍一步法将组织或细胞中加人适量的变性液,匀浆。将混合物移至一管中,按每毫升变性液中立即加人0.1mL乙酸钠、1mL酚、0.2mL氯仿/异戊醇混合液。加人每种组分后,盖上管盖,倒置混匀。将匀浆剧烈振荡 10 s,冰浴15min,使核蛋白质复合体彻底裂解。　然后12000 rpm,4℃离心20min,将上层含 RNA的水相移人一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的 DNA污染的可能性,不要吸取水相的最下层。加人等体积的异丙醇,充分混匀液体，并在－20℃条件下沉淀RNA1h或更长时间。4℃12000rpm离心10min,弃上清,再用75%的乙醇洗涤沉淀；然后离心，再用吸头彻底吸弃上清,在自然条件下于燥沉淀,溶于适量 DEPC处理的水中。 一20℃贮存,备用。5.2.3选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。5.3 反转录5.3.1 取5μL RNA,加 1μL反转录引物,70℃ 5min。5.3.2 冰浴2 min5.3.3继续加人：4 μL5×反转录反应缓冲液2 μL0.1 M DTT2 μL2.5 mmol dNTPs0.5 μLM-MLV反转录酶0.5 μLRNA 酶抑制剂11 μLDEPC 水37℃水浴1 h,合成 cDNA链。取出后,可以直