SN_T 3747-2013杜鹃花枯萎病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3747-2013杜鹃花枯萎病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Ovulinia azaleae Weiss2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3747-2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：段维军、郭立新、陈先锋、张慧丽。I SN/T3747—2013杜鹃花枯萎病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了杜鹃花等寄主植物上的杜鹃花枯萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于杜鹃花枯萎病菌的检疫鉴定，2杜鹃花枯萎病菌基本信息学名：OvuliniaazaleaeWeiss,1940曾用名：Sclerotinia azaleae（F.A.Weiss）Dennis，（1956)无性型：OvulitusazaleaeBuchwald分类地位：真菌界（Fungi）、子囊菌亚门（Ascomycota）、子囊菌纲（Ascomycetes）、柔膜菌目（Helotiales）、核盘菌科（Sclerotiniaceae）、卵孢核盘菌属（Ouulinia）。传播途径：病菌可随风、雨、昆虫和田间操作传播，随感病花瓣远距离传播。该病菌的其他相关资料参见附录A。3方法原理以杜鹃花枯菱病菌的培养性状和病原菌形态特征作为鉴定依据。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备生物显微镜（具测量功能）、体视显微镜、超净工作台、生物培养箱、天平、高压灭菌锅、烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养血（直径9cm）、酒精灯、镊子、剪刀、解刀、接种针、载玻片、盖玻片、荧光灯、滤纸。4.22主要试剂次氯酸钠、玉米粉、琼脂粉、无水乙醇。4.3培养基玉米粉琼脂培养基（CMA）：称取玉米粉200g，加适量蒸馏水煮沸20min左右，双层纱布过滤，在滤汁中加人琼脂20g，继续煮至琼脂完全溶化后，加蒸馏水补足1000mL，121℃高压灭菌20min。5病菌的鉴定5.1症状检查挑取病株，进行观察。病害症状描述参见附录A。1 SN/T 3747-20135.2分离培养取发病花瓣，将病健交界处剪成1mm²～2mm²的小块，或挑取菌核进行分离，1.5%次氯酸钠表面消毒30s，无菌水冲洗3次后，灭菌滤纸吸干水分，置于CMA培养基平板上，20℃培养。5.3有性型诱导收集感病寄主上菌核或培养后获得菌核，置于盛有灭菌潮湿砂的培养皿表面，在20℃下诱导萌发。待子囊柄长出后用荧光灯每天照射16h，以诱导子囊盘形成，制作切片观察子囊盘、子囊、子囊孢子特征。6鉴定特征6.1培养性状在CMA培养基上形成粗糙、质地较硬、毡状菌落.颜色灰白色到浅黄褐色不等。可在培养基上产生菌核和小型分生孢子，但不会产生大型分生孢子，参见附录B。6.2病原菌形态特征菌核卵圆形或饼形，常呈不规测状或明显杯状，凹面光滑。菌核大小约为（2mm～5mm）×（3mm～10mm）×（0.5mm～1.5mm），未成熟时浅褐色.成熟时呈深揭色或黑色。小型分生孢子球形，直径3.0m～3.5-m，产生于聚集成困的拟纺锤形菌丝尖端.有时呈短链状。易脱落，常与菌核同时产生。子囊盘杯状到漏斗状，褐色，具柄，从同一个菌核上可以长出1个～3个不等的子囊盘（最多8个），宽2mm～5mm；子囊柄大小为（2/mm～3mm)（0.5mm~1.5mm），直立或略弯曲，有时会长成弯曲丝状柄，长度可达15mm～18mm，柄基部黏土色，顶部黄褐色；于实层表面红褐色到核桃色不等；子凳圆柱形，大小为（130μm～260m）×（9um14um）；子囊孢子单列排列，椭圆形，单细胞，透明状，(10μm~18μm）×(8.5μm~10 μm).大型分生孢子椭圆形或倒兜球形，透明，大小为（40uμm～60μm）×（21um～36um），在高湿条件下，大型分生孢子呈棍棒状或梨状，长度可送72μm。杜鹃花枯萎病菌的病原形态特征图参见附录C;其与近似种Ouulinia perplera的形态特征区别参见附录D。7结果判定以分离物的培养特征和培养性状作为鉴定依据，进行综合判定。若以上特征与6.1、6.2鉴定特征符合，判定为杜鹃花枯萎病菌。8样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出杜鹃花枯萎病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。2 SN/T3747--201399菌株保存与处理将菌株转接在CMA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（60d)转管，标注分离物来源、寄主、分离时间、鉴定人。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。10结果记录与资料保存妥善保存检验报告，