NY_T 2811-2015橡胶树棒孢霉落叶病病原菌分子检测技术规范.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2811—2015橡胶树棒孢霉落叶病病原菌分子检测技术规范Molecular detection for pathogen of Corynespora leaf fall disease of rubber tree2015-12-01实施2015-10-09发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2811---2015前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：谢艺贤、漆艳香、张欣、蒲金基、张贺、陆英、喻群芳、张辉强。 NY/T 2811---2015橡胶树棒孢霉落叶病病原菌分子检测技术规范1范围本标准规定了橡胶树棒孢霉落叶病病原菌（Corynespora cassiicola）的术语和定义、检测方法、结果判定、样品保存等技术要求。本标准适用于橡胶树的棒孢霉落叶病病原菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1橡胶树棒孢霉落叶病corynespora leaf fall disease of rubber tree由多主棒孢霉[Corynespora cassicola（Berk．et Curt.）Wei］引起的一种为害橡胶树叶片和嫩梢的真菌病害。该病害病原菌的学名、形态特征及其危害症状参见附录A。4检测方法4.1原理根据橡胶树棒孢霉落叶病病原菌核糖体基因内转录间隔区（rDNA-ITS）特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期272bp的DNA片段，判断样品中是否携带橡胶树棒孢霉落叶病病原菌。4.2仪器显微镜（10×40倍）、高压灭菌锅、高速冷冻离心机（最大离心力25000Xg）、PCR扩增仪、电泳仪及紫外凝胶成像仪等。4.3试剂及配制方法4. 3. 11 mol/ L Tris - HCI(pH 8. 0)称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris，优级纯）)溶解于800mL一级超纯水中，用盐酸(HCl,分析纯）调pH至8.0，加超纯水定容至1000mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。4.3.210 mol/L NaOH称取80.0g氢氧化钠（NaOH，分析纯）溶解于160mL一级超纯水中，溶解后再加一级超纯水定容到200mL。4. 3. 3 1 mol/ L EDTA - Na2 (pH 8. 0)称取372.2g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2，优级纯），溶解于70mL一级超纯水中，再加人适量NaOH溶液（4.3.2），加热至完全溶解后，冷却至室温，再用NaOH溶液（4.3.2)调pH至8.0，加超纯水定容至100mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。4.3.4CTAB提取液（pH8.0)1 NY/T 2811—2015称取81.9g氯化钠（NaCl,分析纯)溶解于800mL一级超纯水中，缓慢加人20g十六烷基三甲基漠化铵（CTAB，优级纯），加热并搅拌，充分溶解后加人100mLTris-HCl（4.3.1），4mLEDTA-Naz（4.3.3），加一级超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃)20min，室温保存，研磨植物材料之前加β-巯基乙醇（分析纯)至体积分数为2%。4.3.5CTAB沉淀液称取2.34gNaCl分析纯）溶解于800mL一级超纯水中，缓慢加人50gCTAB（优级纯），加热并搅拌，充分溶解后加一级超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃)20min，室温保存备用。4. 3. 61. 2 mol/L NaCI称取70.2gNaCl(分析纯）溶解于800mL一级超纯水中，加一级超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。4.3.7TE缓冲液(pH8.0)分别量取10mLTris-HCl（4.3.1）和1mLEDTA-Na2（4.3.3），加一级超纯水定容至1000mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。4.3.8加样缓冲液称取250.0mg溴酚蓝（化学纯），加10mL一级超纯水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝（化学纯）溶解于10mL一级超纯水中；称取50.0g蔗糖（化学纯）溶解于30mL一级超纯水中。混合以上3种溶液，加一级超纯水定容至100mL，4℃或室温保存备用。4.