SN_T 4624.8-2016入境环保用微生物菌剂检测方法 第8部分：志贺氏菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4624.8-2016入境环保用微生物菌剂检测方法第8部分：志贺氏菌Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection---Part 8 : Shigella2016-08-23 发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 4624.8-2016前·言SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；第2部分：短小芽孢杆菌；第3部分：巨大芽孢杆菌；-第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；---第5部分:β型溶血性链球菌;一第6部分：金黄色葡萄球菌；-第 7部分：沙门氏菌；-第8部分：志贺氏菌；第9部分：致泻大肠埃希氏菌；第10部分：淡紫拟青霉；第11部分：雅致小克银汉霉；第12部分：哈茨木霉；第13部分：黄孢原毛平革菌；第14部分：焦曲霉；-第15部分：解淀粉芽孢杆菌；一第16部分：类产碱假单胞菌；-第17部分：恶臭假单胞菌。一本部分为SN/T4624的第8部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王金玲、栾慎顺、钟钰、于丽、金学典、王芳。 SN/T 4624.8—2016入境环保用微生物菌剂检测方法第8部分：志贺氏菌1范围SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通 PCR、实时荧光 PCR检测方法。本部分适用于入境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基3.1实验用水：应符合GB/T 6682中一级水的规格。3.2生理盐水：见附录 A 中 A.1。3.33志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见 A.2。3.4麦康凯(MAC)琼脂：见 A.3。3.55木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂：见 A.4。3.66志贺氏菌显色培养基：见A.5。3.7三糖铁(TSI)琼脂：见 A.6。3.8营养琼脂斜面：见A.7。3.9半固体琼脂：见A.8。3.10葡萄糖铵培养基：见 A.9。3.11尿素琼脂：见 A.10。3.12β-半乳糖苷酶培养基：见 A.11。3.13氨基酸脱羧酶试验培养基：见 A.12。3.14糖发酵管：见 A.13。3.15西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.14。3.16蛋白陈水、靛基质试剂：见A.15。3.17志贺氏菌属诊断血清。3.18生化鉴定试剂盒。3.19TE缓冲液（pH8.0)：见 A.16。3.20溶菌酶(10 mg/mL):见 A.17。3.21蛋白酶 K(20 mg/mL):见 A.18。3.2210%SDS:见 A.19。1 SN/T 4624.8--20163.233 mol/L 乙酸钠:见 A.20。3.24dNTP:dATPdTTP、dGTP、dCTP。3.25TBE:见 A.21。3.26Taq DNA 聚合酶。3.27细菌基因组 DNA 提取试剂盒。3.28琼脂糖。3.29溴化乙锭。3.30DNA 分子量标记:100 bp DNA ladder。主要仪器和设备4.4.1电子天平（感量0.01g）。4.2恒温培养箱：36℃±1℃。4.3恒温水浴锅。4.4台式冷冻离心机（最高转速15 000 r/min）。4.5PCR扩增仪。4.6实时荧光 PCR仪。4.7微量移液器和灭菌吸头：10 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL。4.8高压灭菌锅。4.9PCR超净工作台。电泳仪。4.104.11核酸/蛋白分析仪。4.12凝胶成像系统。4.13无菌培养Ⅲ：直径90／mm。5样品制备以无菌操作取1g(mL)样品加人到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加入到225mL灭菌生理盐水中混匀。取样过程中,在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。6形态学及生化鉴定6.1增菌将上述样品匀液吸取 25mL，接种于225mI志贺氏菌增菌肉汤中，经41.5℃士1℃厌氧培养16 h～20 h。6.2分离取增菌后的志贺氏菌增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于 36℃士1℃培养20 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再