SN_T 1135.10-2013马铃薯V病毒检疫鉴定方法.pdf

ICS 65.020.99B 16SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1135.10-2013马铃薯V病毒检疫鉴定方法Detection and identification of potato virus V2013-08-30 发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1135.10—2013前言SN/T1135共分为10部分：第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；第3部分：马铃薯顶病毒检疫鉴定方法；第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；-第5部分·马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法;1111第6部分：马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法；-第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法；第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法；第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法；第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第10部分。本标准按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李彬、闻伟刚、粟智平、田永蕾、吴翠萍、栗寒、刘洪义、王秀芬、李明福。T SN/T 1135.10—2013马铃薯V病毒检疫鉴定方法范围1 本标准规定了马铃薯V病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准适用于所有进出境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质和番茄等茄科作物中可能带有马铃薯V病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3原理3.1马铃薯V病毒学名与分类地位学名:Potato virus V缩写:PVV分类地位：马铃薯Y病毒科（Potylae)马铃薯Y病毒属（Potyiru3.2检疫鉴定依据马铃薯V病毒的血清学特性、分子生物学特性和病毒粒体形态是检疫鉴定的主要依据。该病毒的相关资料参见附录A。4仪器设备、用具及试剂4.1主要仪器设备酶联检测仪、洗板机、高速冷冻台式离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像仪、水浴槽、透射电子显微镜、天平（感量：0.001g）等。4.2　主要用具研钵和研棒、各种量程的可调移液器（2μL,10 μL,20 μL，100μL,200 μL,l000 μL）、各种吸头(10 μL，200 μL,1 000 μL)、96 孔酶标板、离心管(0.2 mL,0.6 mL,1.5 mL)等。4.3主要试剂主要酶联测定试剂见附录B,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测试剂见附录C,实时荧光 RT-PCR检测试剂见附录 D,生物学测定试剂参见附录 E。1 SN/T 1135.10—20135样品制备将马铃薯块茎种植在隔离温室中，于25℃生长并进行症状观察。待长出3～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。对采集的叶片进行酶联免疫吸附测定、RTPCR检测、实时荧光反转录PCR检测、免疫电镜观察或生物学测定。也可以对马铃块茎或其他植物材料直接进行检测。6检测与鉴定6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定(（DAS-ELISA）将制备的样品上清液加已包被PVV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中以样品提取缓冲液为空白对照，阴性对照（如叶片或块茎等）为健康的植物组织，阳性对照为含有PVV的植物组织。检测中，每个样品和对照均需设置两次重复。具体操作见附录 B。6.2RT-PCR 检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中以超纯水为空白对照，阴性对照和阳性对照的设置见6.1。具体操作见附录C。6.3实时荧光RT-PCR检测样品总RNA提取后，采用一步法进行实时荧光RT-PCR扩增，邸反转录过程和实时荧光PCR在同一个PCR管中进行。阳性对照、阴性对照和空白对照的设置见6.2。具体操作见附录D。6.4免疫电子显微镜观察见 SN/T 1840。6.5生物学测定具体操作参见附录E。7 结果判定DAS-ELISA检测结果为阳性，RT-PCR检测结果或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性，可判定待检样品带有马铃薯V病毒。必要时，可采用免疫电子显微镜观察方法或生物学测定方法进行辅助鉴定。8样品与结果记录保存8.1样品保存经鉴定确定携带马铃薯V病毒的