SN_T 1674-2011锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1674—2011代替 SN/T1674-2005锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for Koi herpersvirus disease2011-05-31 发布2011~12-01实施107060159中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1674—2011前創言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准代替了SN/T 1674一2005《锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应操作规程》。本标准与 SN/T1674一2005相比，主要技术变化如下：修改了标准的名称；-增加了“病理变化观察”“电镜观察”及“间接免疫荧光(IFAT)”方法；修改了原标准的 PCR方法。本标准修改采用国际兽疫局（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2009版）中第2.3.6章，主要修改如下：一原文中“Disease information”内容经修改简缩后作为本标准附录 A;一原文第5节内容删去;一原文格式及内容顺序排版上作了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郭明星、江育林、刘、陈建军、黄晟、罗志萍、朱堂明、赵晖。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：--SN/T 1674--2005。 SN/T 1674--2011锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范范围1本标准规定了锦鲤疱疹病毒病诊断的临床症状、采样、间接免疫荧光、组织病理学观察、病毒分离、电镜观察、PCR检测等检疫技术规范。本标准适用于进出境锦鲤疮疹病毒病的检疫2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样3试剂和材料3.1锦鲤疱疹病毒（Koi herpesoirus,KHV):标准毒株由-OIE-参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。3.2细胞系：锦鲤鳍细胞(KF-1)脑组织(CB)细胞系由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。3.3引物3.3.1KHV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)基因PCR扩增引物序列：上游引物:5-GGG TTA CCT GTA CGA G-3下游引物:5-CAC CCAGTA GATAT GC3扩增产物大小为410bp。3.3.2基于检测KHV GraySph基因建立 PCR/方法的引物序列为：KHV SphI 5F:5-GAC ACACA TCT GCA AGG AG-3KHV SphI 5R:5-GAC ACA TGT-TAC AAT GGTCGC-3扩增产物大小为292bp。3.4 Taq酶。3.5 dNTPs:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。3.6无水乙醇：使用前预冷到一20℃。3.7 蛋白酶K。3.8 DNA Marker.3. 9溴化乙锭。器材和设备44.1 PCR扩增仪。4.2电泳仪及电泳槽。 SN/T 1674--20114.3凝胶成像分析仪。4.4恒温培养箱。4.5高速冷冻离心机。4.6细胞培养瓶或培养板。4.7普通光学显微镜、倒置显微镜及电子显微镜4.8切片机。5 临床症状锦鲤疱疹病毒病(Koiherpesvirus disease,KHVD)是一种由锦鲤疱疹病毒引起的鲤鱼和锦鲤的高度传染性败血症疾病，主要临床表现为行动迟缓，鱼眼凹陷，平衡失调，皮肤和鳃苍白、颜色不规则伴有中度至严重的鳃坏死，体表多黏液。该病的传染源为临床上被感染的鱼及隐性带毒鱼，临床症状同许多普通细菌与寄生虫感染的症状相似。患病鱼往往在 1 d～2 d 内即出现死亡(参见附录 A)。6采样6.1直接采样按照GB/T 18088 采样,取鳃、肾、脾脏、脑等组织作为样品。6.2共同培养后取样通常用于检疫比较贵重的鱼，如比较名贵的锦鲤进出境展览检疫等。处理方法：将待检鱼与经检查没有感染KHV的鲤鱼放在检疫隔离场于23℃～28℃下共同饲养2周～4周，按6.1的要求取鲤鱼样作为检疫样品。7 检验方法7.1 病理变化观察取鳃、肾、脾、肝组织制成病理切片,在普通显微镜下观察组织细胞病理变化。典型KHV感染可观察到鳃组织增生、次级鳃丝肥大融合、鳃上皮细胞的细胞核肿大并出现弥散性嗜酸性核内包涵体，肾、脾、肝实质细胞坏死。7.2　电镜观察电子显微镜下进一步观察组织切片,KHV感染的病鱼细胞中能看到弥散性嗜酸性核内包涵体，并可见到有疱疹病毒样粒子。7.3间接免疫荧光（IFAT)将待检鱼放血后,取其肾组织印迹于干净载玻片或者细胞培养皿,空气中风干 20 min,0.01 mo