SN 1226-2003禽痘抗体检测方法 红细胞凝集抑制试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1226—-2003红细胞凝集禽痘抗体检测方法抑制试验Detection antibodies against fowl pox virus--Protocol ofhemagglutination inhibition test2003-12-01实施2003-05-28发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1226—2003前言本标准的附录 A 是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标推主要起草人：林庆燕、卢体康、范万红。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。I SN/T 1226—2003禽痘抗体检测方法红细胞凝集抑制试验1范围本标准规定了应用血凝抑制试验检测禽血清中抗禽痘病毒抗体的方法。本标准适用于禽痘的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。2 引用标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696:1987）3原理本标准采用血凝抑制方法。该方法的原理是利用某些病毒或病毒的血凝素能选择地使某种或几种动物的红细胞发生凝集，当病毒的悬液中先加人特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时,则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制。在已知的禽痘病毒悬液中,加人待检禽血清,若其含有抗禽痘病毒抗体,则能与禽痘病毒相结合,抑制禽痘病毒的血凝作用,这种抑制作用的强弱与禽痘病毒抗体的含量有关。4仪器与试剂4.1仪器96孔V型微量反应板、微量加样器、微量振荡器、离心机及离心管等。4.2 试剂4.2. 1 禽痘病毒凝集抗原、抗禽痘病毒阴、阳性对照血清。5%氯化钠、PBS液、红细胞保存液（阿氏液）、0.5%鸡红细胞悬液。其配制方法见附录 A。待检血清及处理：无菌采集待检动物血液,离心分离血清,56℃水浴灭活 30 min。.4　试验用蒸馏水为GB/T 6682—1992 中的三级水。5操作方法5. 1 血凝试验(HA)5.1.1取干净的96孔V型微量反应板一块，按表1进行操作。单位为微升表 1 禽痘抗原血凝滴度测定101112978孔号2S6342048对照25651210248o1281632抗原稀释倍数2450505050505050505050PBS5050505005050505050505050不同稀释度的抗505050500.5%红细温(20℃~25℃)30 min+X判定举例1 SN/T 1226—20035.1.2用微量加样器吸取PBS,在板上每孔加入50μL。5.1.3用微量加样器吸取50μL禽痘抗原放于第1孔内，充分混匀后，从第1孔中取50μL移至第2孔，充分混勾后，从第2孔中取50μL移至第3孔……至第11孔混匀后，取50μL弃去，第12孔不加抗原作空白对照。5.1.4用微量加样器吸取0.5%红细胞悬液50μuL，依次加人各孔。5.1.5将微量反应板置振荡器振荡2min，使抗原与红细胞充分混合，室温（20℃～25℃）静置30 min判定结果，并作好记录。5.1.6 能引起红细胞完全凝集的病毒最高稀释度作为一个红细胞凝集单位。在血凝抑制试验时使用4个红细胞凝集单位的抗原。表1中1：256为一个红细胞凝集单位，4个单位抗原的稀释倍数为1:64。5. 2 血凝抑制试验(HI)(见表 2)表 2 血清抗体血凝抑制滴度测定单位为微升7孔号456891112 10工163264128阳性2O256阴性抗原空白血清稀释倍数对照PBS2525252525252525002550不同稀释25252525252525250(25)(25)0度的待检阳性阴性血清血清血清(25)252525252525252525250抗原PBS室温(20℃~25℃）静置30min0.5%红细胞25252525252525 2525252545室温（20℃）25℃静置30 min判定举例X++十5. 2. 1在96孔V型微量反应板上用微量加样器加样和稀释样品。5.2.2每孔加 25 μL PBS。5.2.3第1孔加人25μL待检血清，依次倍比稀释至第8孔，最后弃去25μL。5.2. 4第 9 孔加 25 uL阳性血清作阳性对照孔。5.2.5第10孔加25μL阴性血清作阴性对照孔。5.2.6第1孔不加抗原，只加25μLPBS作待检血清对照，第11孔不