SNT 1872-2007出入境口岸霍乱弧菌多重聚合酶链反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1872—2007出入境口岸霍乱弧菌多重聚合酶链反应操作规程Examination codes of multiplex PCR for Vibrio cholerae at entry-exit ports2007-04-06 发布2007-10-16 实施摄 310聘 诊双体中华人民共和国数码防伪发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1872—2007前言本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国·CDC传染病预防控制所、中华人民共和国广西出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨泽、朱海、阙、涂承宁、景怀琦、林继灿、刘洪文、杜联峰、谭勇、叶立青、谭华、王岚。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1872-2007出入境口岸霍乱弧菌多重聚合酶链反应操作规程范围1本标准规定了出人境口岸霍乱弧菌多重PCR检验的对象、检验程序及结果报告。本标准适用于霍乱弧菌菌株的霍乱肠素基因的检验。直接自标本或其增菌液中进行O1群和0139群霍乱弧菌的检测筛查也可参照（参考）使用，以提示进行进一步的菌株分离。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。比不注期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验空用承规格和试验方法GB15984霍乱诊断标准及处瑾原则GB 19489实验室生物安全通用要求SN/T 1239国境口岸霍乱检验规程WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应托3术语和定义下列术语和定义适用于本标3.1polymerase chain reactidn,PCR聚合酶链反应在体外用于扩增位于两段已知序刻(引物)之间的DNA区段的方法。3.2多重 PCR multiplex PCR在同一试管中加人多对引物、在个反应过程中扩增同一模板的几个目标基因片段。4缩略语下列缩略语适合于本标准。4.1VC Vibrio Cholerae霍乱弧菌。4.2ctxA Cholera enterotoxin A霍乱弧菌肠毒素 A。4.3toxR Central regulatory protein ToxR中心调节蛋白。1 SN/T 1872—20074. 4PCR polymerase chain reaction聚合酶链反应。4.5dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷三磷酸。4.6dATP deoxyadenosine triphosphate脱氧腺苷三磷酸。4.7dGTP deoxyguanosine triphosphate脱氧鸟苷三磷酸。4.8dCTP deoxycytidine triphosphate脱氧胞苷三磷酸。4.9dTTP deoxythymidine triphosphate脱氧胸苷三磷酸。4.10SDS sodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠。4.11Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷。4. 12Taq 酶 Taq DNA polymeraseTaq DNA 聚合酶。4.13PBS phosphate-buffered saline磷酸盐缓冲液。5 对象5.1霍乱弧菌菌株。5.2霍乱感染病例、霍乱感染嫌疑人的排泄物、呕吐物及其增菌液5.3被霍乱弧菌污染或有霍乱弧菌污染嫌疑的水生动物、食品、饮用水、压舱水和环境样本及其增菌液。6 检验程序6.1准备6.1.1实验室准备检验设备和材料，所需设备和材料参见附录A。实验室生物安全符合GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定。PCR防污染措施按WS/T230要求。6.1.2对所采集的样本应进行标志,标志应具唯一性。2 SN/T 1872--20076.2 实验室检验6.2.1样品采集、增菌培养和细菌分离鉴定按照GB15984和SN/T1239相关标准进行。6.2.2用于细菌 DNA 提取的样本的前处理霍乱弧菌菌株的处理用无菌环从平板上取四分之一个到1个纯菌落的菌量，混悬于100μL的纯水中。模板提取见6.2.3.取纯菌的LB或碱性蛋白陈增菌液1mL加到1.5mL离心管中，以12000r/min离心2min集菌，去上清液，用1 mL生理盐水或pH 7.4的 PBS洗一遍,8000 r/min离心5min，尽量吸干上清;沉淀物