SNT 2301-2009国境口岸登革热病毒的实时荧光RT-PCR快速检测方法.pdf

:7: 1.中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2301--2009国境口岸登革病毒的实时荧光RT-PCR快速检测方法Rapidly detecting method for dengue virus by real-time fluorescence RT-PCRat frontier port2009-07-07发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局9510561515数码防伪 SN/T 2301—2009言前本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郑夔、黄吉城、洪烨、李小波、幸芦琴、师永霞、钟玉清、相大鹏、郭波旋、胡龙飞、陈永红。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2301—2009国境口岸登革病毒的实时荧光RT-PCR快速检测方法1 范围本标准适用于国境口岸人出境人或蚊类携带登革病毒的实时荧光 RT-PCR快速检测，包括检测对象、标本采集和处理；检测程序，结果判定及报告本标准适用于国境口岸入出境人员或蚊类携带登革病毒的实验室检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是禾注明日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。人间传染的病原微生物名录（卫生部2006 年）3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1登革病毒dengue virus登革病毒属黄病毒科黄病毒属,包括 Ⅱ、Ⅱ、血、IV 四种血清型,是有包膜的单股正链 RNA病毒。登革病毒可感染人，并引起登革热，严重者基至可引起登出血热或登革休克综合征。埃及伊蚊和白纹伊蚊是登革病毒的主要传播媒介3.2实时荧光 RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR实时荧光 RT-PCR方法有多种,本标准采用的是/TaqMan 水解探针法,其原理是在常规 RT-PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核育酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR扩增时，利用 Taq 酶的5-3外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR 产物形成完全同步。4缩略语下列缩略语适用于本标准。4.1RT-PCR reverse trancription polymerase chain reaction逆转录聚合酶链式反应。4.2Ct 值 cycle threshold循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 SN/T 2301—20094.3 MEM minimal essential medium最低必须培养基。4.4RNA Iribonucleic acid核糖核酸。4.5DEPC diethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯。4.6FAM 6-carboxy-fluorescein6-羧基-荧光素，一种荧光报告基团。4.7MGB minor groove binger小沟结合物，一种荧光灭基团。4.8BHQ . black hole quencher黑洞淬灭基团。4.9LNA locked nucleic acid锁核酸。5生物安全措施中华人民共和国卫生部发布的《人间传染的病原微生物名录》规定，登革病毒危害程度分类为第三类，所有有关登革病毒的实验室操作应按照以下规定执行：-登革病毒培养和动物感染实验应在生物安全二级(BSL-2或ABSL-2)实验室内进行;-未经培养的登革病毒感染性材料的操作应在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行；登革病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行;登革病毒感染性材料运输包装分类为A类（仅培养物为A类）,UN编号为UN2814。6 对象疑似感染登革病毒的人出境人员：疑似携带登革病毒的媒介蚊虫。仪器和设备1需要如下仪器设备：荧光定量PCR仪；生物安全柜；普通冰箱；-70℃超低温冰箱；普通台式离心机；高速冷冻离心机（转速可达20000g）；-微量可调移液器(10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头； SN/T 2301—2009-Eppendorf 管(1. 5 mL);-涡旋器。8 试剂8.1 MEM 和 Hanks液商业化产品，也可参见附录A配制。8.2标本处理液在新鲜配制的95mL MEM中加人56℃热灭活30 m