SN_T 2641-2010食品中常见致病菌检测 PCR-DHPLC法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2641—2010食品中常见致病菌检测PCR-DHPLC 法Detection of pathogen in food-PCR-DHPLC method2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布B国家质量监督检验检疫总局数码防价 SN/T2641—2010前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：曹际娟、郑秋月、徐君怡、黄晓蓉、耿丽梅、孙哲平、王旭、于畅、邵碧英、郑晶、杨春华、王振国、高晓博。- SN/T2641—2010食品中常见致病菌检测PCR-DHPLC 法1范围本标准规定了食品中沙门氏菌等30种致病菌的PCR-DHPLC检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌等30种致病菌的快速检测。注：30种常见致病菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、嗜热弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌、乳酸杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA(deoxyribonuleicacid)：脱氧核糖核酸dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷酸三磷酸DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography)：变性高效液相色谱PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应Taq（Thermusaquaticu）：水生栖热菌TEAA：三乙基铵醋酸盐4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489中的有关规定执行。5废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施参照标准GB/T27403执行。 SN/T2641—20106原理DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺醋酸盐缓冲溶液（TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。7试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格，所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。7.1TaqDNA聚合酶。7.2dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。7.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HClpH8.4)，200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。7. 4引物：引物序列见附录表A.1。7.5TE溶液。7.610% SDS。7.7蛋白酶K(20mg/mL）。7.8氯化钠（NaCl)：5mol/L和0.7mol/L7. 910% CTAB。7. 10三氯甲烷。7. 11异戊醇。7. 12酚。7.13异丙醇。7.1470%乙醇。7. 155DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50mLTEAA和250uL乙睛混合，加水定容至1000mL；缓冲溶液B为50mLTEAA和250mL乙腈混合，加水定容至1000mL，缓冲溶液D为75%乙睛。8主要仪器和设备8.1PCR仪。8.2 DHPLC仪。8.3高速离心机：离心转速18000g。8.4PCR超净工作台。8.5微量可调移液器和灭菌吸头：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。8.63灭菌PCR反应管。9方法提要与检测程序9.1方法提要本方法利用DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，灵敏地检测