NY_T 2114-2012大豆疫霉病菌检疫检测与鉴定方法.pdf

ICS 65.020B 15NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2114—2012大豆疫霉病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification of Phytophthora sojae Kaufmann Gerdemann2012-02-21发布2012-05-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2114—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、南京农业大学、黑龙江省植检植保站。本标准主要起草人：王福祥、陈继光、王源超、项宇、焦晓丹、熊红利、戴婷婷、隋广义、杜淑梅、朱莉。I NY/T2114—2012大豆疫霉病菌检疫检测与鉴定方法1范围本标准规定了大豆疫霉病菌的现场和室内检疫检测及鉴定方法。本标准适用于大豆植株、土壤样品以及大豆籽粒（包括种子)中大豆疫霉病菌的检疫检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3原理大豆疫霉病菌（Phytophthora sojae KaufmannGerdemann)属藻菌界(Chromista)，卵菌门(Oo-mycota），霜霉目（Peronosporales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉属（Phytophthora），可侵染大豆根、茎、叶、豆荚及籽粒，但以引起大豆根腐病和茎腐病较为普遍。常规检测中，可根据分离培养中病原菌的菌丝、孢子囊及卵孢子形态特征进行鉴定;PCR检测中，利用特异引物对病菌DNA扩增时获得的特异DNA片段进行鉴定。4试剂与材料传统分离培养所用基础培养基及选择性培养基，参见附录A;叶碟诱捕所用试剂，参见附录B;PCR所用试剂配制及用途，参见附录C。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682--2008中一级水的规格。5仪器与用具解剖刀、培养血、高压灭菌锅、烘箱、培养箱天平（感量1/100；1/10000）、研钵、粉碎机、数显摇床、水浴锅、制冰机、纯水器、旋涡震荡器、台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、PCR仪、真空抽干仪、低温冰箱、超净工作台、锥形瓶、玻璃试管、筛网（200目、400目、600目）、生物显微镜（油镜镜头、目镜和镜台测微尺或测量软件）、烧杯、载玻片、盖玻片、电泳设备、紫外凝胶成像仪、微量进样器。6现场检测6.1植株症状诊断在大豆生长期进行田间症状目测踏查，重点调查田边地头及地势低洼积水处。根据大豆疫霉病典型症状（参见附录D)进行诊断。对于田间不能确定的，采集疑似症状的植株样本进行室内检验鉴定，必要时采集疑似发病植株根际周围深0cm~10cm土壤100g进行室内检验6.2豆粒检验检查并收集大豆种子或原粮中不饱满、青癌的豆粒，夹带的病残体及夹杂的土壤样品，带回实验室检测。7室内检测7.1新鲜植株检测1 NY/T 211420127.1.1分离鉴定将大豆植株用自来水洗净，晾干组织表面的水；用次氯酸钠对分离部位进行表面消毒（时间30s）；用灭菌解刀切取0.5cm²大小的病健交界处组织置于选择性培养基表面，需注意培养基表面的水分一定要事先吹干，于25℃培养箱中培养2d～3d,根据培养基上菌落形态、菌丝颜色，在低倍镜下观察菌丝形态特征（参见附录E)，即可判断是否为大豆疫霉病菌。无法判断的，可参照7.1.2进行PCR检测。7.1.2PCR检测取一段新发病的植株组织，在研钵中充分研磨后，转移磨碎后的发病组织2mg～3mg至1.5mL的离心管中，每毫克发病组织加人10μL浓度为0.5mol/L的NaOH，13200g离心5min。取5μL上清液加人495μL浓度为0.1mmol/LTris缓冲液（pH=8.0），混匀后取1μL直接用于PCR反应，PCR扩增程序均见附录F。此方法也适用于提取长在培养基上的新鲜菌丝的DNA。7.2病残体的检测病残体可用PCR法进行检测。首先进行病残体中病原菌DNA模板的提取：将实验用的器血清洗干净，并灭菌；挑选出可疑的病残体，用粉碎机将样品打碎成粉末，称取100mg，加液氮充分研磨，迅速加预热的CTAB抽提液1.5mL，置于65℃水浴锅中30min，期间不断振荡，13200g离心15min；取上清液，加人RNase酶解（终浓度为10mg/L），37℃保温30min后，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，混匀，13200g离心15min；吸取上清液，再次加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，混匀，