SN_T 3567.2-2015交叉引物恒温扩增检测方法 第2部分：霍乱弧菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3567.2—2015交叉引物恒温扩增检测方法第2部分：霍乱弧菌Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 2:Vibrio cholerae2016-07-01实施2015-12-04发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局司 SN/T3567.2—2015前言SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为以下几个部分：第1部分：通用技术规程；第2部分：霍乱弧菌；第3部分：大肠杆菌0157：H7；—第4部分：黄热病毒；第5部分：沙门菌属；第6部分：结核分枝杆菌；..本部分为SN/T3567的第2部分。本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：祁军、李燕、王树祥、王馨、胡林。I SN/T3567.2—2015交叉引物恒温扩增检测方法第2部分：霍乱弧菌1范围SN/T3567的本部分规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测霍乱弧菌的生物安全措施、检测对象、试剂和材料、仪器设备及检测程序。本部分适用于在国境口岸对（乱弧菌菌株的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的的引用文件，仅注日期的版本适用于本文凡是注日修改单)适用于本文件。件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的GB/T6682分析实验室用水规格和试验方通用要求GB19489实验室生物安SN/T1022进出口食品中乱弧菌检验方法SN/T1239验验规程国境口岸霍乱技术规程SN/T3567.1交叉引物恒温扩WS289霍乱诊断标准人间传染的病原微生物名录（3术语、定义和缩略语3.1术语和定义月于本文SN/T3567.1界定的以及3.1.1霍乱弧菌Vibriocholerae;01群及群。霍乱是一种烈性肠道传染病，其发病引起霍乱的病原体。其主要致病血清急、传染性强、病死率高，属于检疫传染病。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。dTTP脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dCTP脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）PBS磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline)4生物安全措施实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定，由具备相关资格1 SN/T3567.2—2015的工作人员进行。5检测对象5.1疑似霍乱弧菌的待检菌株。5.2霍乱感染病例或疑似霍乱感染者的排泄物、呕吐物及其增菌液。6试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，包括：按照GB/T6682规定的一级水。DNA提取液：5%Chelex水溶液10×ThermoPol缓冲液。10mmol/LdNTPs溶液：dATP，dTTP,dCTP,dGTP各2.5mol/L。BstDNA聚合酶：8U/μL。甜菜碱溶液：5mol/L。硫酸镁溶液：1mol/L。引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。7仪器设备所用仪器设备如下：任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪微量移液器：量程范围为0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL。计时器。超净工作台。生物安全柜。消毒灭菌锅。高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。台式离心机（最高离心力2000g以上）。涡旋振荡器。低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。8检测程序8.1样本标识样本应进行唯一性标识。8.2样本采集、细菌增菌及分离鉴定按照WS289、SN/T1239和SN/T1022执行。2 SN/T3567.2—20158.3样本前处理8.3.1疑似霍乱弧菌的待检菌株培养基上纯培养物用无菌接种环挑取1/4～1个菌落，混悬于100μL灭菌或无菌双蒸水或纯水中。LB或碱性蛋白陈水的处理纯培养物取纯培养的1mL加到1.5mL离心管中，以14000g离心2min集菌，弃去上清液，用1mL生理盐水或pH7.4PBS洗涤沉淀物，悬浮，4000g离心5min，弃去上清液。8.3.2粪便和呕吐物直接从粪便和呕吐物样本中提取模板时，可取水样粪便或呕吐物约200μL或200mg，加人1mLpH7.4PBS混匀，300g离心5min，收集上清液于1.5mL离心管中，6000g离心5min，弃去上清液，保留沉淀。8.4模板DNA提取8.4.1加热煮沸法提取取40μL经前处