SN_T 2497.19-2010进出口危险化学品安全试验方法 第19部分：Northern Blot实验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2497.19---2010进出口危险化学品安全试验方法第 19 部分：Northern Blot 实验Test method of import and export dangerous chemicals--Part 19 : Test of Northern Blot2010-03-02发布2010-09-16实施华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T2497.19---2010前言SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分：第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞（PFC)试验：第3部分：大型泽繁殖试验；-第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第5部分：睾丸细胞UDS试验；第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验：第7部分：小鼠耳肿胀试验；第8部分：帼窝淋巴结试验；第9部分：血清溶血素测定试验；第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验；-第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；-第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第15部分：PCR-SSCP实验；第16部分：Western-Blot实验；第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；-第18部分：DNA加合物的检测方法；第19部分：NorthernBlot实验；-第20部分：Bradford法测定蛋白质含量；第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分：DNA的Tm值测定方法；第23部分：细胞器的分离实验方法；第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；第25部分：体液免疫功能试验；-第26部分：巨噬细胞功能试验；-第27部分：流式细胞术检测调亡；一第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第29部分：生化需氧量（BOD)测定。本部分为SN/T2497系列标准的第19部分。本部分修改采用《分子克隆实验指南》第二版，其有关技术内容与上述方法完全致，在标准文本格式上按GB/T1.1一2000做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局。本部分主要起草人：于艳军、王利兵、李晶、李学洋、赵好力宝、昌刚。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2497.19--2010进出口危险化学品安全试验方法第19部分：NorthernBlot实验1范围SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品NorthernBlot实验的主要试剂和材料、主要仪器设备、试验步骤和结果分析。本部分适用于检测进出口危险化学品引起的基因转录异常。2术语、定义和缩略语2.1术语和定义下列术语和定义适用于本部分。2.1.1核酸探针nucleicacid probe能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。2.2缩略语下列缩略语适用于本部分。2.2.1MOPS3-(N-玛琳代）丙磺酸2.2.2RNA核糖核酸3原理在变性条件下将待检的RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA或RNA探针进行杂交和放射自显影。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，从而显示出待检RNA的片段及其相对大小。4试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。4.15×甲醛凝胶电泳缓冲液：0.1mol/I.MOPS（pH值7.0），40mmol/I.乙酸钠，5mmol/I.EDTA(pH值8.0)。4.2甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA（pH值8.0），0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF。4.3溴化乙锭溶液：0.5μL/ml，用0.1mol/L.乙酸铵配制。4.420×SSC溶液：在800ml.水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加人数滴10mol/I.NaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。4.52×SSC，由20XSSC溶液稀释而成。4.6杂交液：50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt试剂，0.1%SDS5仪器设备5.1电泳仪。 SN/T 2497.19--20105.2凝胶成像系统。6试验步骤6.1甲醛琼脂糖凝胶电泳6.1.1制备凝胶：将适量琼脂糖溶于水，冷却至60℃，加人5×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终液浓度分别为1×和2.2mol/1（将12.3mol/I.甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和5×甲醛凝胶电泳缓冲液按1：3.5：1.1比例混合）。在化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置3