SC_T 7210-2011鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法.pdf

ICS 67.120.30B 50SC中华人民共和国水产行业标准SC/T 7210-2011鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法Method for detection of Anisakis simplex larva in fish2011-09-01 发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部发布 SC/T 7210—2011前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本标准主要起草单位：中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。本标准主要起草人：吴山功、王桂堂、孙喜模、陈爱平、姚卫建、朱泽闻。I SC/T 7210—2011鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法1范围本标准规定了简单异尖线虫（Anisakissimplex）幼虫形态学鉴定和聚合酶链式反应（PCR)检测方法。本标准适用于鱼类简单异尖线虫幼虫的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696：1987）GB/T18088出入境动物检疫采样3试剂和溶液除另有说明外，所有试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682中一级水的指标。3.1生理盐水：0.85g氯化钠溶于100mL蒸馏水中，室温保存。3.2巴氏液：0.85g氯化钠和3mL甲醛溶液溶于97mL蒸馏水中，室温保存。3.310%的甘油酒精：10mL甘油溶于90mL70%的酒精中，室温保存。3.4乙醇：70%、80%的乙醇以及无水乙醇。3.5乳酸酚透明液：按甘油：苯酚：乳酸：蒸馏水的体积比2：1：1：1的比例配置，室温保存。3.6TE:10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)1mmol/LEDTA(pH 8.0),在1.05kg/ cm²高压下蒸汽灭菌20min，于4℃贮存。3.710%SDS溶液：10gSDS溶于90mL蒸馏水中，68℃助溶，调pH至7.2，最后加水定容至100mL，室温保存。3.8抽提缓冲液I：400μLTE、16μL蛋白酶K(5mg/mL)和20μL10%SDS的混合溶液。3.9抽提缓冲液Ⅱ：按Tris溶液饱和过的重蒸酚：氯仿：异戊醇以25：24：1的比例混合，密闭避光4℃保存。3.10MgCl2:25.0 mmol/L。3.11TAE缓冲溶液：按Tris碱4.84g、冰乙酸1.142mL和NazEDTA·2HzO0.744mL加水定容到1 000 mL.3.121.0%琼脂糖：琼脂糖1g溶于100mLTAE中。3.13Tag酶：一20℃保存，避免反复冻融。3.14蛋白酶K：一20℃保存，避免反复冻融。3. 15 dNTPs:含 dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各 10mmol/L。3. 16 10XPCR buffer:500. 0 mmol/L pH8. 8 的 Tris-HCI、500. 0 mmol/ L 的 KCl 和 1%的 TritonX100混合溶液。3.17矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。3.18分子量标准：推荐使用DL2000marker，4℃保存；长期贮存应分装置于一20℃，避免反复冻融。1 SC/T 7210-20113.19溴酚蓝指示剂溶液：溴酚蓝100mg，双蒸水5mL，室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后与溴酚蓝溶液混合，摇匀后定容至50mL，加NaOH调至蓝色。4仪器和设备4.1电子天平。4.2剪刀、镊子、昆虫针和手术刀。4.3体视显微镜及普通光学显微镜。4.4酒精灯。4.5培养皿。4.6普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.7普通冰箱和超低温冰箱。4.8微量移液器和Tip头。4.9PCR扩增仪。4.10离心管和PCR管。4.11紫外透射仪。4.12水平电泳仪。5寄生虫分离和固定5.1分离按GB/T18088的标准采样抽样检查。从鱼腹腔、胃、肠系膜、肝脏、生殖腺、肌肉等组织中分离虫体。5.2固定将虫体置于有生理盐水的培养皿中，然后将部分虫体置于巴氏液中固定用于形态学观察；部分虫体置于80%的乙醇溶液中用于后续分子生物学检测。6形态鉴定6.1样品处理将用巴氏液固定的虫体取出后置于10%的甘油酒精中透明，在显微镜下观察其形态特征；对于透明不好的结构，用乳酸酚透明液透明后再观察形态特征。6.2形态特征幼虫活体呈乳白色、半透明，在生理盐水中时而卷曲呈盘状，时而如蚓样蠕动。虫体长圆筒形，两端略细，体长10mm～30mm。前端钝圆，口唇