SN_T 1151.1-2011虾桃拉综合征检疫技术规范.pdf

.中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1151.1—2011代替 SN/T 1151.1--2002虾桃拉综合征检疫技术规范Quarantine protocol for shrimp taura syndrome2011-12-01实施2011-05-31发布中华人民共和国发布y国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1151.1—2011前言SN/T1151系列标准共分为六部分：-虾桃拉综合征检疫技术规范；对虾白斑病检疫技术规范；斑节对虾杆状病毒(MBV)诊断方法；虾黄头病检疫技术规范；-对虾杆状病毒(BP)检验方法;对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程。本部分为SN/T1151的第1部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分代替 SN/T 1151.12002《对虾 Taura 综合征病毒（TSV）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)诊断方法》。本部分与 SN/T1151.1-2002 相比，主要技术内容变化如下：整合和优化RT-PCR检测方法；新增 Real-time RT-PCR检测方法。本部分修改采用世界动物卫生组织（OIE)的《水生动物疾病诊断手册》（2009版）第2.2.4章，并对虾桃拉综合征 RT-PCR检测方法进行了整合和优化。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本部分主要起草人：熊炜、张强、刘、郑腾、蒋静、李健、邱璐、王巧全、黄忠荣、胡永强。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1151.1-—2002。1 SN/T 1151.1—2011虾桃拉综合征检疫技术规范1范围SN/T 1151 的本部分规定了虾桃拉综合征 RT-PCR 和Real-time RT-PCR 检测的操作方法。本部分适用于虾桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出入境动物检疫采样3概述ndrome virus，TSV)感染而引起桃拉综合征（Taura syndrome)是一种由桃拉综合征病毒（Taura的严重威胁虾养殖的重要疫病，它是世界动物卫生组织(OIE)规定的需上报的水生动物疫病。TSV几乎能感染所有类型的养殖虾,如：南美白对虾、红额角对虾褐对虾、白对虾、斑节对虾等，并感染孵化期的虾苗,其致死率高。TSV感染有三个明显的阶段急性期、过渡期和慢性期。在急性期，虾表皮上皮的组织切片中可以看到典型的病理损伤。市在过期和慢性期，却没有典型的病理损伤;虾发病死亡主要发生在急性期，急性感染后的幸存者在经过短誓的过渡期后，进人长时间的慢性感染期，处于慢性感染期的虾的淋巴器官终生持续有病毒存在,这些携带有病毒的虾可把病毒水平传播给其他易感虾。病毒学研究证实，TSV是一种小的正二十面体无包膜病毒,直径32nm，其基因组为单正链RNA 由10205个核苷酸组成，含有两个大的开放阅读框（Opeh read frame，ORF)，ORF1编码非结构蛋白如解旋酶、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶等，ORF2编码结构蛋白如衣壳蛋白VP1、VP2、VP3(其分子量大小分别为55kDa、40kDa、24kDa）。4试剂和材料4.1Tag酶及 10 倍 Tag酶浓缩缓冲液:Tag酶浓度为 5 U/μL，一20℃保存,避免反复冻融，4.2逆转录酶及10倍逆转录酶浓缩缓冲液：逆转录酶浓度为50 U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。4.3RNA酶抑制剂：浓度为 40U/uL，一20℃保存,避免反复冻融。4. 4 dNTP:含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 10 mmol/L,-20 ℃保存。4.5RT-PCR引物：引物浓度均为20μmol/L;引物有两对，可任选其-使用；引物9992F和9195R为OIE推荐引物，其扩增基因片段的大小为231bp,引物 TSVF和 TSVR扩增的基因片段大小为295bp，其序列如下：上游引物(9992F):5-AAG-TAG-ACA-GCC-GCG-CTT-3下游引物(9195R):5-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-3上游引物(TSVF):5-ATT-GAA-TAC-TTA-GCA-CAG-CGA-CC-3下游引物(TSVR):5-GAA-CAC-CAC-TAC-CAT-AGG-GGA-G-31 SN/T 1151.1—20114.6Real-time RT-PCR引物和探针：引物TSV1004F、TSV1075R和探针TSV-P1为