SN_T 2773-2011国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法 属通用引物基因悬浮芯片法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2773—2011国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法属通用引物基因悬浮芯片法Rapid simultaneous screen method for five bio-terrorism bacteria at frontierport--Gene suspension array with universal primers on genus level2011-07-01实施2011-02-25 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、河北国际旅行卫生保健中心。本标准主要起草人：杨宇、张晓龙、孙肖红、王惠兰、张乐、王静、杨永莉。T SN/T 2773—2011国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法‧属通用引物基因悬浮芯片法范围1本标准规定了用于国境口岸快速筛查炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis，B.a）、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,Y.p)、布鲁菌(Brteetta-spp:,Brt)~土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,F. t)和类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,B.p)五种重要生物恐怖病原菌的基因悬浮芯片筛查方法。本标准适用于国境口岸发现的可疑物品或环境样品中五种重要生物恐怖病原菌的筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应角是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室‧生物安全通用要求SN/T 1552　国境口岸生物因子恐怖事件监测规程WS 233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义下列术语和定义适用于体文件3. 1 bio-terrorism bacteria生物恐怖病原菌可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌，主要包括炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌等，其特点是感染剂量低、毒性高、致病性强，感染后潜伏期短、发病率高；传染性强，可通过不同途径感染人体；在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和释放。3.2基因悬浮芯片gene suspension array利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸进行大规模测定的一种生物芯片技术。4‘生物安全防护要求4.1排查前做好个人防护。防护方法和标准见 SN/T 1552。4.2实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全Ⅱ级(BSL-2)实验室的生物安全要求。4.3使用过的实验用品应遵照GB19489的要求，对废弃物应进行无害化处理。 SN/T 2773—20115主要设备与试剂5.1主要设备悬浮芯片系统、荧光显微镜、水平电泳仪、凝胶成像系统、离心机、PCR仪、生物安全柜、移液器、核酸蛋白检测仪、真空泵、涡流振荡仪。5.2主要试剂LB液体培养基（见 A.1）、LB固体培养基（见 A.2）、DSM芽孢培养基（见 A.3）、PCR反应预混液（见A.4）、氯化四甲铵（TMAC)、1.5×TMAC杂交液（见A.5）、1×TMAC杂交液（见A.6）、羧基化编码微球、2[N-吗啉}乙磺酸（MES)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)、SDS、N-十二烷基肌氨酸钠、链亲和素-藻红蛋白（SA-PE）、乙二胺四乙酸（EDTA）、6mol/L碘化钠（NaI)、玻璃粉、70%乙醇、Tris 饱和酚、三氯甲烷、吐温-20。6检测方法6.1样品采集依 SN/T 1552执行。6.2细菌 DNA 提取6.2.1取0.1g样本加500μLPBS(见A.8),1000g离心3min;取上清液,12000g离心1min,弃去上清液。6.2.2沉淀用PBS洗涤 3次后，向每管样本中加人 6mol/L碘化钠100μL，振荡混匀 30 s，煮沸30 min,间或混匀。6.2.3将上述煮沸处理的样本于10000g离心5min，将上清转至另一含500μL20%玻璃粉悬液的1.5 mL离心(EP)管中。充分混匀,置室温10 min,期间每 2 min混匀 1 次,使暴露的 DNA 吸附于玻璃粉上。6.2.4　8000g离心2 min，,小心倾去上清液。6.2.5向玻璃粉DNA沉淀中加人75%乙醇1mL,充分混匀，洗涤玻璃粉，8000g离心2min，小心倾去上清液。6.2.6重复洗涤一次后，8000g离心2min