NY 680-2003禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法.pdf

ICS 11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 680—2003禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法Enzyme-linked immunosorbent assayfor avian leukosis virus p27 antigen2003-07-30 发布2003-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 680--2003前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：陈西钊、苏敬良、王宏伟、田克恭、吴清民、王传彬。 NY/T 680—2003禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法1范围1本标准规定了禽白血病病毒(ALV)p27 抗原酶联免疫吸附试验方法。....本标准适用于检测鸡蛋蛋清以及鸡胚组织细胞培养物中的 ALV·p27蛋白抗原。2P27 抗原酶联免疫吸附试验2.1试验材料2.1.1 试剂抗p27蛋白抗体：应用提纯的禽成髓细胞性白血病病毒p27蛋白免疫家兔制备。2. 1. 1. 2阳性抗原:含鸡白血病/肉瘤病毒群特异性 p27蛋白抗原的鸡蛋清。2. 1. 1. 3↓阴性抗原:无鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的 SPF鸡蛋清。2. 1. 1. 4酶结合物：辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体。2. 1. 1.5磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见第A.1章。2.1. 1.6包被液：配制见第A.2章。洗涤液：配制见第A.3章。2. 1. 1.8样品稀释液：配制见第A.4章。2. 1. 1.9底物溶液：配制见第A.6章。2. 1. 1. 10终止液：配制见第A.7章。2.1.2器材a）1酶联检测仪;b）聚苯乙烯板；c）微量加样器,容量50 μL～200μL;d）37℃恒温培养箱。2.1.3样品鸡蛋样品：将待检鸡蛋小的一端朝上放置，打碎蛋壳，用移液器无菌吸取蛋清，密装于灭菌小瓶内。细胞培养物：用移液器无菌吸取细胞培养物，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃保存或立即送检。试验前将送检样品统一编号，试验时不做稀释。2.2操作方法2. 2. 1用包被液将抗p27蛋白抗体作4000倍稀释，每孔100μL加人96孔聚苯乙烯板中，4℃过夜。2.2.2取出包被好的聚苯乙烯板,将液体倒弃，每孔加250 μL洗涤液漂洗三次，每次2 min,甩干。2.2.3每孔加150μL质量浓度为1%的明胶封闭液，37℃反应60min。2.2.4重复 2.2.2。2.2.5在A1、A²孔各加100μL标准阴性对照,As、A4孔各加100 μL标准阳性对照。2.2.6将待检样品加人其他各孔，每个待检样本加两孔，每孔100μL,37℃反应60min。2.2.7重复2.2.2。2.2.8每孔加100μL工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体,37℃反应60min。 NY/T 680--20032.2.9重复 2.2.2。2.2.10每孔加100μL新配制的底物溶液，室温，避光反应10min。2.2.11每孔加100 μL终止液。2.2.12置酶联检测仪于450 nm 测定各孔吸光度(OD)值。2.3结果判定2.3.1阴性对照OD均值等于（A,孔OD值十A2孔OD值)/2;阳性对照OD均值等于（A：孔OD值+A4孔OD值)/2。2.3.2阴性对照OD均值小于0.15，阳性对照OD均值减去阴性对照OD均值大于0.3时试验成立，否则重做。2.3.3S/P等于(样品孔 OD 均值-阴性对照 OD均值)÷(阳性对照 OD 均值一阴性对照OD均值)。待检样本S/P小于等于0.2判为阴性，表示待检样品中无ALVsp27蛋白抗原。待检样本S/P大于0.2判为阳性，表示待检样品中有ALVsp2?蛋白抗原。2 NY/T 680—2003附 录A（规范性附录）试剂的配制1磷酸盐缓冲液(PBS,0. 01 mol/L pH7. 4)A. 18g氯化钠0.2 g氯化钾磷酸二氢钾0.2 g2.83 g十二水磷酸氢二钠加至 1 000 mL蒸馏水：包被液(0.05 mol/L pH9.6)A.21.59 g碳酸钠2.93 g碳酸氢钠加至1 000 mL蒸馏水A.33洗涤液1 000 mLPBS0.5 mLTween-20A.4样品稀释液含体积分数10%新生牛血清的洗涤液。5磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）A.53.26 g柠檬酸12.9 g十二水磷酸氢二钠700 mL蒸馏水A.6底物溶液用二甲基亚砜将3355-四甲基联苯胺(TMB)配成1%的浓度，4℃保存。使用时按下列配方配制底物溶液。9.9 mL磷酸盐-柠檬酸缓冲液0.1 mL1%3355-四甲基联苯胺1 μL30%双氧水A,7终止液58 mL硫酸442 mL蒸馏水 E002—089 L/XN中华人民共和国