SN_T 3678-2013碱茅腥黑粉菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3678-2013碱茅腥黑粉菌检疫鉴定方法Detection and identification of Tilletia puccinelliae Carris,Castl. G.Huang.2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3678—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘跃庭、罗加凤、蔡国瑞、黄国明、廖芳。I SN/T 3678---2013碱茅腥黑粉菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了碱茅腥黑粉菌（TilletiapuccinelliaeCarris，Castl.G.Huang.）菌瘘检查、冬孢子形态测定、萌发实验等的步骤和方法。本标准适用于碱茅种子中碱茅腥黑粉菌的检疫鉴定，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18085—2000植物检疫小麦矮化腿黑穗病菌检疫鉴定方法3碱茅腥黑粉菌基本信息学名：TilletiapuccinelliaeCarris,Castl.G.Huang中文名称：碱茅腥黑粉菌分类地位：碱茅腥黑粉菌属真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），黑粉菌纲（Ustilaginomyce-tes），外担子菌亚纲（Exobasidiomycetidae），腥黑粉菌目（Tilletiales），腥黑粉菌科（Tilletiaceae），腥黑粉菌属（Tilletia）。寄主：碱茅Puccinellia distans（L.）Parl.分布：美国4方法原理病菌菌瘦及冬孢子形态特征、冬孢子萌发生理特性(参见附录A)为碱茅腥黑粉菌的检疫鉴定依据。5器材和试剂5.1仪器设备放大镜、灭菌培养血（直径9cm）、三角瓶、离心管、离心管（1.5mL）、镊子、酒精灯、载玻片、盖玻片等。低速离心机、往复式振荡器、涡旋振荡器、体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平（感量0.01g）、高压灭菌锅等。5.2试剂和培养基吐温-20（Tween-20）、席尔氏浮载剂（见GB/T18085一2000中附录A席尔氏浮载剂配制方法）、琼脂、0.25%次氯酸钠（NaC1O）、无水乙醇。3%水琼脂培养基。1 SN/T3678-20136病菌的鉴定6.1洗涤检验待检样品在样品袋内充分混匀，制成平均样品，从平均样品中称取50g倒人灭菌三角瓶内，加蒸馅水100mL，吐温-201～2滴，用铝铂纸或Parafilm膜封住三角瓶瓶口，放在往复式振荡器上振荡5min后，洗涤液1000r/min离心5min，倾上清液，席尔氏液悬浮沉淀。离心沉淀液在显微镜下镜检，检查是否有表面呈网状的腥黑粉病菌冬孢子。每份试验样品的离心沉淀液至少检查5张玻片，每片按视野依次全部检查。镜检发现有孢壁纹饰网眼状的腥黑粉病菌冬孢子，挑菌瘦作进一步的检疫鉴定。6.2菌瘦检测将待检样品倒人灭菌白瓷盘内，在充足光线下仔细检查有无菌瘦，碱茅种子个体很小，碱茅腥黑粉菌菌瘦肉眼不能确定，需在体视显微镜下仔细辩别菌瘦。受腥黑粉病菌侵染的种子被病菌粉状冬孢子代替而成为菌瘦，菌瘦较健康种子粗短、饱满，暗灰色、褐色或黑褐色，冬孢子堆深褐色或黑褐色（参见图A.1）。体视显微镜下测量菌瘦长度和宽度。6.3冬孢子形态测量发现黑粉病菌菌瘦，挑取少许冬孢子加适量席尔氏液制片，放置24h后，随机选取30个成熟冬孢子油镜下（1000×）进行相关数据的测量，包括冬孢子直径、网脊高度、一直径上网目数。6.4冬孢子萌发试验在Eppendorf离心管中加人适量0.25%的次氯酸钠溶液，挑取-定数量的冬孢子放人，用涡旋振荡器振荡50s使孢子均勾分散开，以3000r/min离心1min，立即用微量加样器吸去上清液（涡旋振荡器与离心处理时间不超过3min），加无菌水离心清洗两次，将冬孢子沉淀物转至3%水琼脂平板上培养，每一培养温度重复3个培养皿。培养条件：5℃、10℃、15℃，连续光照。在显微镜（100×）下观察冬孢子的萌发情况，培养4d后开始观察，以后每隔3d观察一次，显微镜（400×）下观测初生担子数目和担子间是否有融合现象，（400×）或（1000×）下测量初生担子和次生担子大小，记录并进行显微拍摄。7鉴定特征7.1为害症状及菌瘦特征病菌为害植株子房，充满冬孢子的菌瘦代替子粒，菌瘦比种子稍膨大，（0.9mm～1.5mm）×(0.5mm