SNT 2497.24-2010进出口危险化学品安全试验方法 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2497.242010进出口危险化学品安全试验方法第24部分：细胞免疫功能体外检测方法Test method of import and export dangerous chemicals-Part 24 : Vitro test of cell immunologic function2010-09-16 实施2010-03-02发布.中华人民共和国803发布防国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2497.24-2010前創言SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分：第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验；第3部分：大型泽繁殖试验；第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第5部分：睾丸细胞UDS试验；第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第7部分：小鼠耳肿胀试验；第8部分：窝淋巴结试验；第9部分：血清溶血素测定试验；第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验；第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第15部分：PCR-SSCP实验；第16 部分：Western-Blot 实验；第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；第18部分：DNA加合物的检测方法；第 19 部分：Northern Blot 实验;第20部分：Bradford法测定蛋白质含量；第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分:DNA的 Tm值测定方法；第23部分：细胞器的分离实验方法；第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；第25部分：体液免疫功能试验；第26部分：巨噬细胞功能试验；第27部分：流式细胞术检测调亡；第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第29部分：生化需氧量（BOD)测定。本部分为SN/T2497系列标准的第24部分。本部分修改采用《毒理学实验方法与技术》中的免疫毒理学研究方法，其有关技术内容与上述方法完全一致,在标准文本格式上按GB/T 1.1做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吕刚、王利兵、冯智勐、李学洋、熊中强、赵好力宝。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2497.24—2010进出口危险化学品安全试验方法第24部分：细胞免疫功能体外检测方法 范围SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中体外细胞免疫功能试验的试验原理、试验方法和试验结果。本部分适用于检测进出口危险化学品安全性的细胞免疫毒性的体外检测试验。2试验原理人外周血 T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体(E受体,即 CD2 分子，而 B淋巴细胞表面则没有。因而在体外，当将淋巴细胞与绵羊红细胞混合时，可形成以T淋巴细胞为中心，周围环绕绵羊红细胞的玫瑰花样的花环。该试验可用于检测外周血中T淋巴细胞的数目与比例。3试验方法3.1 试剂3.1.1淋巴细胞分离液、肝素、无钙、镁的 Hanks液pH值 7.2～7.6、Alsever 溶液、0.8%戊二醛、0.2%冷美兰。3.1.2绵羊红细胞用Alsever溶液保存的新鲜绵羊血经洗涤后，配制1%绵羊红细胞悬液。3.1.3吸收灭活胎牛血清胎牛血清经56℃30mln灭活后，按每毫升胎牛血清加入洗涤过的压积绵羊红细胞0.1mL，混匀，37℃孵育30min，然后2000r/min离心20min取上清置4.℃保存。3. 2 试验步骤3.2.1取肝素防凝血 3 mL,加3 mL Hanks 液对倍稀释,并沿管壁缓缓将血加到淋巴细胞分离液之上,2 000 r/min离心 20 min。3.2.2小心吸取分离液界面白色的单个核细胞层（含有淋巴细胞），用Hanks 液洗涤 2次,调整细胞浓度为2×10°个/mL备用。3.2.3在一支新华氏管内加人淋巴细胞悬液0.1mL、经吸收灭活的胎牛血清0.1mL、1%绵羊红细胞悬液 0.1 mL混匀,37℃孵育 5 min,然后 500 r/min离心5 min。将试管置于 4℃冰箱,至少 2 h。3.2.4取出试管，弃去部分上清，轻轻旋转华氏管使细胞混匀，然后沿管壁加1滴0.8%戊二醛固定，置于 4℃冰箱20 min。3.2.5轻轻吸取1滴滴片，再加1滴0.2%冷美兰，染5min，盖上盖玻片，高倍镜下观察玫瑰花环形成情况。4试验结果凡淋巴细胞周围吸附3个或3个以上绵羊红细胞者即为E-花环形成阳性，计数200个淋巴细胞，计算E-花环形成的百分率，见式（1）。1 SN/T 2497.24—2010形成花环的淋巴细胞数形成花环淋色细胞