SN_T 2754.10-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第10部分：产气荚膜梭菌.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2754.10---2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP)检测方法第10部分：产气荚膜梭菌Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogensin export food--Part 10 :Clostridium perfringens2011-02-25发布2011-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2754.10—2011前 言SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法》共分为15个部分：第1部分：金黄色葡萄球菌；第2部分：大肠杆菌0157;第3部分：志贺氏菌；-第4部分：单核细胞增生李斯特菌；第 5部分:副溶血性弧菌;第6部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；第 7部分:空肠弯曲菌;第8部分：肺炎克雷伯氏菌；第9部分：溶血性链球菌;第10部分：产气荚膜梭菌；第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；-第12部分：溶藻弧菌；第13部分：创伤弧菌；第14部分：假结核耶尔森氏菌；第15部分：阪崎肠杆菌。本部分为SN/T2754的第10部分。本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国盐城出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：游淑珠、王小玉、冯家望、邝筱珊、徐帮兴、李志勇、曹以诚、杜正平、成晓维、杨一帆、王志强、陈洵、高东微。 SN/T 2754.10—2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第10部分：产气荚膜梭菌范围1SN/T2754的本部分规定了检测出口食品中产气英膜梭菌的环介导恒温核酸扩增（LAMP)法。本部分适用于出口食品中产气荚膜梭菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.13食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室　生物安全通用要求GB/T27403实验室质量腔制规范食品分子生物学检测3生物安全措施为了保护实验室人员的安全全，应由具备资格的工作人员检测产气英膜梭菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。4防污染措施防止污染措施应符合GBXT27403的规定。5缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine：甜菜碱Bst 酶[Bst DNA polymerase （large fragment)J:Bst DNA 聚合酶(大片段)DNA（deoxyribonucleic acid):脱氧核糖核酸dNTP（deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷三磷酸EDTA（ethylenediamine tetraacetic acid):乙二胺四乙酸LAMP（loop-mediated isothermal amplification）:环介导恒温扩增Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚6技术概要根据产气荚膜梭菌特有的靶序列16SrRNA基因（参见附录A)设计的两对特殊的内、外引物，特异 SN/T 2754.10—2011性识别靶序列上的六个独立区域，利用 Bst酶启动循环链置换反应，在16SrRNA基因序列启动互补链合成,在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，加人显色液,即可通过颜色变化观察判定结果。7 试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。7.1引物：根据产气荚膜梭菌特有的靶序列16SrRNA基因设计一套特异性引物,包括外引物1,外引物2和内引物1,内引物2。外引物扩增片段长度：207bp。外弓引物1(F3,5′-3):AACCTTCATCACTCACGCG外引物 2(B3,5-3):GCAATCCGCTATGAGATGGA内引物1(FIP,5′-3):TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA内引物 2(BIP,5′-3):CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG7.2DNA 提取试剂。7.2.1 TE 缓冲液:10